中华人民共和国国家标准
GB/T 20755-2006
Method for the determination of nine penicillins residues inlivestork and poultry muscles-LC-MS-MSmethod
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局本标准主要起草人：庞国芳、李学民、张进杰、曹彦忠、刘晓茂、范春林、刘永明、赵为.本标准系首次发布的国家标准.
畜禽肉中九种青霉素类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛、羊、猪和鸡肉中九种青霉素类药物残留量的液相色谱-串联质谱测定方法.
本标准适用于牛、羊、猪和鸡肉中九种青霉素类药物残留量的测定，
本标准的方法检出限：慕夫西林为0.25gg/kg，青霉素G为0.5μg/kg，账拉西林、青霉素V.苯唑西林为1.0μg/kg，阿莫西林、氨苄西林、氯唑西林、双氯西林为2.0μg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 1-2004 ISO 5725-1;1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT)
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-1992，neq ISO3696：1987)
3原理
试样中青霉素类药物残留，用0.15mol/L磷酸二氢钠（pH=8.5）缓冲溶液提取，经离心，上清液用固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2乙晴：色谱纯. 4.3磷酸二氢钠（NaHPO）.4.4氢氧化钠.4.5乙酸，4.6乙晴水（11)：量取50mL乙（4.2）与50mL水混合.4.7氢氧化钠溶液：5mol/L.称取20g氢氧化钠（4.4），用水溶解，定容至100mL. 4.8磷酸二氢钠缓冲溶液：0.15mol/L.称取18.0g磷酸二氢钠（4.3），用水溶解，定容至1000mL，然后用氢氧化钠溶液（4.7）调节至pH=8.5.4.9阿莫西林、氨苄西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、茶夫西林、双氯西林九种青霉素标准物质：纯度≥99%.4.10九种青霉素标准储备溶液：准确称取适量的每种标准物质（4.9），分别用水配制成浓度为 1.0mg/mL的标准储备溶液.储备液贮存在一18C冰柜中.4.11九种青霉素标准工作溶液：根据需要吸取适量的每种青霉素标准储备溶液（4.10），用空白样品提
GB/T 20755-2006
取液稀释成适当浓度的基质混合标准工作溶液.4.12BUNDELUT C固相萃取柱或相当者：500mg，6mL.使用前分别用5mL甲醇（4.1）、5mL4.130.2μm滤膜. 水和10mL磷酸二氢钠缓冲溶液（4.8）预处理，保持柱体湿润.
5仪器
5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g. 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源.5.3振荡器.5.4固相萃取真空装置，5.5贮液器：50mL.5.6微量注射器：25gL 100l5.7刻度样品管：5mL，精度为0.1mL. 5.8离心机：带有50mL具塞离心管.5.9pH计：测量精度0.02pH单位，
6测定步骤
6.1试样溶液的制备
称取3g试样（精确到0.01g）置于离心机（5.8）中，加人25mL磷酸二氢钠缓冲溶液（4.8），于振荡器上振荡10min，然后，以4000r/min离心10min 把上层提取液移至下接BUNDELUT C固相萃取柱（4.12）的贮液器中，以3mL/min的流速通过固相萃取柱后，用2mL水洗柱，弃去全部流出液.用3mL乙腾水（4.6）洗脱，收集洗脱液于刻度样品管（5.7）中，用乙晴水定容至3mL，摇匀后，过 0.2gm滤膜（4.13），供液相色谱-串联质谱仪测定.按照上述操作步骤制备空白样品提取液.
6.2测定
6.2.1液相色谱条件
a）色谱柱：SunFireCs3.5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；c）桂温：30C： b）流动相梯度程序及流速见表1；d）进样量：20gL.
表1流动相梯度程序及流速
时间/ 流速/ 水（含0 3%乙酸）/ 乙（含0.3%乙酸）min (pL/min) （%） （%)0 00 200 95 0 5 03 00 3 01 200 95 0 50 0 50 0 5 013 00 200 200 50 0 50 013 01 200 25 0 75 018 00 200 25 0 75 018 01 200 95 0 5 025 00 200 95 0 5 0
6.2.2质谱条件
a）离子源：电喷雾离子源； b）扫描方式；正离子扫描；c）检测方式：多反应监测：d）电喷雾电压：5500V：e） 雾化气压力：0.055MPa;气帘气压力；0 079MPa； 辅助气流速：6L/min；h) 离子源温度：400C；i）定性离子对、定量离子对和去蕨电压（DP）、聚焦电压（FP）、碰撞气能量（CE）及碰撞室出口电压（CXP）见表2.
表2九种青霉素的定性离子对、定量离子对、去簇电压、聚焦电压、碰撞气能量和碰撞室出口电压
名称 高子对 定性 离子对 定量 碰撞气 能量/ 电压/ 去 电压/ 聚焦 出口电压/ 硬撤室(n/≥） (m/≥） V V V v阿莫西林 366/114 30atoxicillin 366/208 366/208 19 21 06 10氨苄西林 350/192 350/160 23 20 90 10ampieillin 350/160 20piperacillin 原畴西林 518/160 518/143 35 27 25 90 10518/143 35penicillin G 青霉素G 09t/s88 335/176 335/160 20 20 23 90 10青霉素V 351/160 20penicillin V 351/192 351/160 15 40 90 10苯唑西林 402/160 20oxacillin 402/243 402/160 20 23 90 10氯唑西林 436/160 436/160 21 20 90 10cloxacillin 436/277 22茶夫西林 415/199 415/199 23 23 90 10nafeillin 415/171 52dicloxaeillin 双氯西林 470/160 470/311 470/160 20 22 20 06 10
6.2.3液相色谱-串联质谱测定
6.2.3.1定性测定
选择每种待测物质的一个母离子，二个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与基质标准溶液中对应物质的保留时间偏差在士2.5%之内；样品色谱图中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准溶液的色谱图中离子相对丰度相比，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品 中存在对应的待测物.
