中华人民共和国国家标准
GB/T21105-2007
Identification of Canis derived materials in animal-originatedfeedstuffs-PCRmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出. 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口.本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局.本标准首次发布. 本标准主要起草人：高宏伟、梁成珠、王岩、于立新、徐宝梁、陈颖、吴亚君、宗卉、温燕辉、曹际娟.
动物源性饲料中狗源性成分定性 检测方法PCR方法
1范围
本标准规定了动物源性饲料中狗（Canis）源性成分检测的PCR方法，该检测方法的检出限为0.1%.
本标准适用于动物源性饲料中狗源性成分的定性检测.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699.1何料采样(GB/T 14699 1-2005.1SO 6497:2002IDT)
SN/T1193基因检验实验室技术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
3. 1
聚合酶链式反应polymerase chainreaction：PCR
用于扩增位于两段已知序列之间DNA（deoxyribonucleosidea acid.脱氧核糖核酸）的方法.模板别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP（de- DNA经过高温变性成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分oxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸）为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火循环，扩增倍数达到约10°.
4原理
利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA：以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物：PCR阳性产物应用限制性内切酶酶切反应进行确证.
5试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB6682的要求.
5.1狗源性成分检测用引物（对）序列为：canis F:5'-TCCAGGTAAACCCTTCTT-3′canis R:5′-TACGAGCAAGGGTTGATGG-3'5.2TaqDNA聚合酶（Tag.Thermus aquatica，水生栖热菌）. 5.3限制性内切酶：HphI酵. upxop）.p(q usoapxop.ps.N
phate，脱氧胸苷三磷酸） dCTP（deoxycytidine triphosphate 脱氧胞苷三磷酸），dGTP(deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟昔三磷酸）.5.6澳化乙锭. 5.5琼脂糖：电泳纯.5.7三氯甲烷.5.8异丙醇.5.970%乙醇.5.11裂解液：1%CTAB（cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵）.0.05 mol/LTris-HCl(pH 8.0）[Tris ：tris （hydroxymethy1）aminomethane三（羟甲基）氨基甲烷]o. 7 mol/L NaCl0. 01 mol/L EDTA(pH8. 0)(ethylene diaminetetraacetic acid 乙二胺四乙酸).5.12TE缓冲液（Tris-HCI EDTA 缓冲液）; 10 mmol/L Tris-HCI （pH8. 0)，1 mmol/L EDTA5. 13 10 × PCR 缓冲液 :100 mmol/1L KC1 160 mmol/ L (NH );SO 20 mmol/L MgSO 200 mmol/L (pH8.0).Tris-HC1（pH8. 8），1%Triton X-100（1-octylphenoxypolyethoxyethanol，辛基苯氧基聚乙氧乙醇），1 mg/mL BSA(bovine serum albumin 牛 血清蛋白) 5.14电缓冲液：Tris 54 g，硼酸 27.5 g0.5mol/LTE缓冲液（pH8. 0)20mL，加蒸镭水至1 000 mL; 使用时10倍稀释.5.15澳化乙锭贮存液：用水配制成10mg/mL.5.16加样缓冲液：0.25%澳酚蓝.40%（质量浓度）蔗糖水溶液.5. 17醇切缓冲液:10 mrol/ 1 Tris-HC1 (pH7 5) 10 mmol/ L MgCl 50 mmol/ L NaCl 0. 1 mg/mL BSA
6仪器设备
6.1DNA热循环仪，6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.6.4离心机：离心力12000g. 6.3恒温水浴锅6.5微量移液器.6.6电泳仪.6.7紫外检测仪.6.9天平：感量0.01g. 6.8pH计
7试样选取与制备
按照GB/T14699.1采样，将实验室样品粉碎，充分混合均匀后待用.
8检验步骤
8.1样品的总DNA提取
心管中，加人600uL~800L裂解液，65C30min.期间不时振荡混匀；12000g离心5min：转移上清 于洁净离心管中，加400αL三氯甲烷异戊醇（241），混匀；12000g离心5min，取上清液；加0.8倍体积异丙醇，沉淀：12000g离心5min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加人50uLTE，溶解沉淀.
也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA.
8.2DNA浓度和纯度的测定
取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和 280nm处的吸光值A和A.DNA的浓度按式（1）计算：
式中：
（-DNA浓度，单位为微克每微升（ug/pL）；
A260nm处的吸光值；
N核酸稀释倍数.
当A/A比值在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增.
8.3PCR扩增
25μL的反应体系，在0.2mL的 PCR反应管中.引物 canisF和canisR各200nmol/L 10×PCR反应缓冲液，2mmol/LMgCl.20Onmol/LdNTPs 1.5UTaq DNA聚合酶，1.0LDNA模板（100ng土50ngDNA）.设立阳性对照、阴性对照、空白对照组.
PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般的反应程序为：94C预变性3min.94C变性45s 56℃退火45s.72C延伸45s.35个循环.72C延伸5min4C保存.
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照.用已知含狗源性成分的样品作阳性对照.用已知不含狗源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照.
8.4PCR扩增产物电泳检测
取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加人溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5pg/ml，制胶.在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶.将5μL~8gLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样.9V/cm恒压电泳，直至澳酚蓝指示剂迁移至凝胶中部.紫外检测仪下观察电泳结果并记录.
8.5限制性内切酶酶切及产物电泳检测
如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应.反应体系（20L）：HphI酵2U，酵切缓冲液2lL 加人PCR扩增产物至总体积20μL.酶切在37C下进行，20min.酶切完成后电泳，方法见8.4.
9结果判断与表述
9.1PCR扩增产物电泳检测结果
阳性样品的PCR扩增产物大小为213bp（序列参考附录A）.
9.2限制性内切酶酶切结果
阳性样品PCR产物采用内切酶HphI酶切后，酵切片段大小为179 bp和34bp.
9.3结果表述
PCR产物和酶切产物都为阳性者判为含有狗源性成分，表述为检出狗源性成分；PCR产物为阴性者判为不含有狗源性成分，表述为未检出狗源性成分.
10检测过程中防止交叉污染的措施
按照SN/T 1193执行.
11康弃物处理
检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理.
