中华人民共和国国家标准
GB/T 21108-2007
Determination of choramphenicol in feedsHigh performance liquid chromatography tandem mass spectometry
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国农业部提出. 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口.本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、国家饲料质量监督检验中心（北京）.本标准主要起草人：赵根龙、高生、宋荣、张发旺.
本标准首次发布.
饲料中氯霉素的测定 高效液相色谱串联质谱法
1范围
本标准规定了测定饲料中氯霉素的高效液相色谱中联质谱法（LC/MS/MS）.
本标准适用于配合词料和预混合饲料中氯霉素的测定，其最低定量限为10μg/kg最低检测浓度为5μg/kg-
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1何料采样(GB/T 14699.1-2005.1SO 6497:2002-IDT)
3原理
萃取除去脂溶性杂质.再将氯霉素回提至乙酸乙酯，吹干.用乙晴水溶液溶解，过C小柱净化，最后 饲料中的氯霉素用乙酸乙酯提取，取部分提取液用氮气吹干，残渣溶于甲醇氯化钠溶液，用正已烷用LC/MS/MS法分离、检测和定量.
4试剂与材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂.水为蒸馏水，色谱用水符合GB/T6682的一级用水的规定.
4.1乙睛：色谱纯.4.2甲醇：色谱纯.4.3乙酸乙酯.4.5三氯甲烷. 4.4正已烷.4.6乙晴溶液4.6.1乙晴溶液1：取5.0mL乙晴加水95mL.4.6.2乙晴溶液Il：吸取乙睛50mL加水50mL.4.7氯化钠4.8氯化钠溶液：浓度为40g/L，称取40.0g氯化钠（4.7）加水溶解定容到1000ml. 4.9氯化钠甲醇溶液：取200mL甲醇（4.2）加氯化钠溶液（4.8）800mL.4.10氯霉素标准品：纯度大于98%，4.11氯霉素标准液溶液氯霉素浓度为1mg/mL，密封贮于冰箱内，有效期为一年.
4.11.1标准贮备液：准确称取100mg土0.1mg氯霉素标准品（4.10）用乙腊溶解，定容到100mL，该
4.11.2标准中间液I：吸取标准贮备液（4.11.1)5.00mL，于50mL容量瓶内，用乙溶液Ⅱ（4.6.2）定容至50mL，该溶液氯霉素浓度为100μg/mL，密封贮于冰箱内，有效期3个月.
GB/T 21108-2007
4.11.3标准中间液Ⅱ：吸取标准中间液I（4.11.2)1.00mL于100mL容量瓶内，用乙晴溶液I（4.6.2）定容至100mL，该溶液氯霉素浓度为1.0μg/mL，密封贮于冰箱内，有效期为3个月.4.11.4标准中间液Ⅲl：吸取标准中间液II（4.11.3）10.00mL于100mL容量瓶内，用乙晴溶液Il （4.6.2）定容至100mL.该溶液氯霉素浓度为100ng/mL，密封于冰箱内，有效期为7天.4.11.5标准工作溶液：用移液管分别吸取标准中间液Ⅲ（4.11.4)1、5.10、50mL于4个100mL容量瓶内，用乙晴溶液Ⅱ（4.6.2）定容至刻度.该溶液氯霉素浓度为1.0、5.0、10、50ng/ml.4.12C固相萃取（SPE）小柱：载体200mg、承载液体体积3mL.
5仪器
5.1离心机：转速为4000r/min以上.5.2超声波提取器.5.3涡旋混合器.5.4密封盖塑料离心管：50mL. 5.5液相色谱串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）的液相色谱串联质谱仪.
6试样的制备
筛，混合均匀，装人磨口瓶中备用. 按GB/T14699.1选取有代表性的实验室样品，用四分法缩分至约200g，粉碎过0.45mm孔径
7分析步骤
7.1提取
（5.4）加40.0mL乙酸乙酯（4.3）盖好密封盖于涡旋混合器上混合2min.放入超声波提取器中提取 称取一定量的试样（配合饲料5g，预混合饲料1g，精确至0.001g），置于50mL塑料离心管内20min，其间用手摇动两次.将离心管取出，置离心机上（5.1）4000r/min离心分离4min.用移液管取上清液20mL，于50C加热器上用氮气吹至近干，待净化.
7.2净化
7.2.1凌-液分配净化
用氯化钠甲醇溶液（4.9）2、1、1mL分三次溶解残渣（7.1），均转移到同一个10mL具塞试管内.加4mL正已烷，涡旋混合2min，放人离心机于4000r/min离心4min，弃去上层正已烷，重复上述操作一次.水相加乙酸乙酯（4.3）3mL，涡旋混合2min，放人离心机4000r/min离心4min，吸取上层乙酸乙酯，水相置另一个5mL具塞试管内，加乙酸乙酯（4.3）2mL重复上述操作一次.吸取上层乙酸 乙酯，置于上述同一个水相具塞试管内，置加热器上50C下，用氮气吹干.用3mL乙溶液I（4.6.1）溶解，待SPE小柱净化.
7.2.2SPE柱净化
每一试样各准备一支C小柱（4.12），顺序用5mL甲醇，5mL三氯甲烷，5mL甲醇和10mL水预清洗C柱.将样液（7.2.1）过此小柱（流速<1mL/min），用5mL乙晴溶液I（4.6.1）淋洗，最后用 3mL乙晴溶液Ⅱ（4.6.2）洗脱，收集洗脱液于10mL具塞试管内.洗脱液加5mL乙酸乙酯涡旋混合1min，2000r/min离心，下层水相用乙酸乙酯重复萃取一次，合并乙酸乙酯提取液于5mL具塞试管内.在加热器上（50C）用氮气吹干，用2mL乙溶液Ⅱ（4.6.2）溶解，调节试样溶液浓度，使上机浓度不高于100ng/mL. 7.3测定 7.3.1液相色谱条件 色谱柱：C柱，柱长150mm，柱内径2.1mm.粒度3.5pm或性能类似的分析柱. 柱温：室温.流动相组成：乙睛水=3070（VV）.流动相流速：250 μL/min. 进样量：10gL. 7.3.2质谱条件 电喷雾离子源（ESI）负离子方式检测.喷雾电压：3500V.壳气流速：0.68L/min 辅助气流速：3.6L/min.毛细管温度：300C母离子321，二级子离子为257，152、121.碰撞电压如表1： 表1氯霉素的子离子及其碰撞电压 母离子 子离子 碰撞压力/eV321 257 23321 321 152 121 18 12 7.3.3试样的测定 在上述仅器条件下，分别注入标准工作液（4.11.5）和试样溶液（7.2.2）10L.以保留时间和二级子离子（m/z）257、152、121进行定性，其相对丰度比见表2.以152作为定量子离子，并用氯霉素标准工作液做单点或多点校准，以峰面积比较进行定量计算. 表2氯霉素的子离子及相对丰度比 子离子（m/x) 257 152 121相对丰度/% 100 90±18 8±4 8结果计算与表述 8.1结果计算 试样中氯霉素的含量X，以质量分数微克每千克（μg/kg）表示，单点校准时可用式（1）计算： 式中： P-试样溶液对应的色谱峰面积响应值；V一加人定容液的体积，单位为毫升（mL）；-氯霉素标准溶液的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V氯霉素标准溶液的进样体积，单位为微升（gL)； n稀释倍数：P-氯霉素标准溶液对应的色谱峰面积响应值；m试样质量，单位为克（g）； V试样溶液的进样体积，单位为微升（guL). 多点校准时可用式（2）计算： (2)
