中华人民共和国国家标准
GB/T21981-2008
动物源食品中激素多残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法
Determination of hormone multiresidues in foodstuffs ofanimal origin-LC-MS/MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准附录A和附录B为规范性附录，附录C、附录D、附录E、附录F和附录G均为资料性附录.本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出. 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会归口，本标准起草单位：北京市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、中国检验检疫科学研究院.
本标准主要起草人：邵兵、杨奕、张品、吴永宁、储晓刚.
动物源食品中激素多残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法
1范围
本标准规定了动物源食品中激素残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法.
本标准适用于猪肉、猪肝、鸡蛋、牛奶、牛肉、鸡肉和虾等动物源食品中50种激素（见附录A）残留的确证和定量测定，
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992，neqISO3696：1987）
3方法提要
试样中的目标化合物经均质，酶解，用甲醇-水溶液提取，经固相萃取富集净化，液相色谱-质谱/质谱仪测定，内标法定量.
4试剂和材料
除特殊注明外，本标准所用试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇.4.2二氯甲烷， 4.3乙睛.4.4甲酸，4.5乙酸：分析纯.4.6乙酸钠（NaAC4H:O):分析纯.4.7β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶溶液（β-glucuronidase/arylsulfatase）：4.5U/mLβ葡萄糖醛酸 酶，14U/mL芳香基硫酸酯酶.4.8乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH5.2）：称取43.0g乙酸钠（NaAC4HO），加人22mL乙酸，用水溶解并定容到1000mL.用乙酸调节pH到5.2.4.9甲醇-水溶液（11，体积比）：取50mL甲醇和50mL水混合.4.110.1%甲酸水溶液：精确量取甲酸1mL加水稀释至1000mL.4.12标准品：去甲雄烯二酮、群勃龙、勃地酬、氟甲睾酮、诺龙、雄烯二酮、睾酮、普拉雄酮、甲睾酮、异率酮、表雄酮、康力龙、179羟基雄烷-3-酮、美率酮、达那唑、美雄诺龙、羟甲雄烯二酮、美雄醇、雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌醇、已烷雌酚、已烯雌酚、已二烯雌酚、炔诺酮、21a-羟基孕酮、17a-羟基孕酮、左炔诺孕酮、甲羟孕酮、乙酸甲地孕酮、孕酮、甲羟孕酮乙酸酯、乙酸氯地孕酮、曲安西龙、醛固酮、凌尼松、可的松、氢 化可的松、泼尼松龙、氟米松、地塞米松、乙酸氟氢可的松、甲基泼尼松龙、倍氯米松、曲安奈德、氟轻松、氟米龙、布地奈德、丙酸氯倍他索，纯度均大于97%.物质英文名称及CAS号见附录A.
GB/T 21981-2008
4.13同位素内标：炔诺孕酮-d、孕酮-d、甲地孕酮乙酸酯-d、甲羟孕酮-d、美仑孕酮-d、炔诺酮-"C、---由--9--4.14标准储备液：分别准确称取10.0mg的标准品及内标于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至 酮-d、雌二醇-C、已烯雌酚-d、已二烯雌酚-d、已烷雌酚-d，物质英文名称见附录B.刻度制成1.0mg/mL标准储备液，-18C以下保存，标准储备液在12个月内稳定.4.15混合内标工作液：用甲醇将各标准储备溶液配制成浓度为100gg/L的混合内标工作液.4.16混合标准工作液：根据需要，用甲醇-水溶液（4.9）将各标准储备溶液配制为适当浓度（0.5，1.2，物浓度的5倍），标准工作溶液中含各内标浓度为10ug/L.(4.10)、6mL甲醇、6mL水活化.
4.18氨基固相萃取柱（500mg.6mL），使用前用6mL二氯甲烷-甲醇溶液（4.10）活化.
5仪器
5.1液相色谱中联四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源.5.2电子天平：感量为0.001g和0.01g.5.3组织匀浆机. 5.4涡旋混合器.5.5恒温振荡器.5.6超声清洗仪.5.7离心机：10 000 r/min.5.8固相萃取装置. 5.9氮吹仪.5.10pH计.5.11移液器.
6试样制备
6.1动物肌肉、肝脏、虾
从所取全部样品中取出有代表性样品约500g，剔除筋膜，虾去除头和壳.用组织搞碎机充分搞碎均匀，均分成两份，分别装人洁净容器中，密封，并标明标记，于一18亡以下冷冻存放.
6.2牛奶
从所取全部样品中取出有代表性样品约500g，充分摇匀，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封，并标明标记，于0C~4C以下冷藏存放.
6.3鸡蛋
从所取全部样品中取出有代表性样品约500g去壳后用组织热辞机充分搅拌均匀，均分成两份，分别装人洁净容器中，密封，并标明标记，于0C～4C以下冷藏存放.
注：制样操作过程中应防止样品被污染或其中的残留物发生变化.
7分析步额
7.1提取
称取5g试样（精确至0.01g）于50mL具塞塑料离心管中，准确加人内标溶液（4.15）100L和10 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.8）.涡旋混匀，再加人p-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶溶液100uL，于37C士1C振荡酶解12h.取出冷却至室温，加人25mL甲醇超声提取30min，0℃~4C下2
10 000r/min离心10min.将上清液转人洁净烧杯.加水100mL，混匀后待净化.
7.2净化
提取液（7.1)以2mL/min~3mL/min的速度上样于活化过的ENV1-Carb固相萃取柱（4.17）.将液（4.10）洗脱并收集洗脱液，取下ENV1-Carb小柱，再用2mL二氯甲烷-甲醇溶液（4.10）洗氨基柱，洗脱液在微弱的氮气流下吹干，用1mL甲醇-水溶液（4.9）溶解残渣，供仪器测定.
8测定
8.1雄激素、孕激素、皮质醇激素测定
8.1.1液相色谱条件
a）色谱柱：ACQUITYUPLCTMBEHC柱.2.1mm（内径）X100mm，1.7m，或相当者.c）流速：0.3mL/min b）流动相：A，0.1%甲酸水溶液（4.11)；B.甲醇.梯度淋洗，参考梯度条件参见表C.1.d）柱温：40C，e）进样量：10pl
8.1.2雄激素、孕激素测定参考质谱条件
a）电离源：电喷雾正离子模式. b）毛细管电压：3.5kV.c）源温度：100C，d）脱溶剂气温度：450℃.e）脱溶剂气流量：700L/hg）雄激素、孕激素的特征离子参见表D.1和表D.2. f）碰撞室压力：0.31Pa(（3.1×10²mbar）.
8.1.3皮质醇激素测定参考质谱条件
a）电离源：电喷雾负离子模式，b）毛细管电压：3.0kV.c）源温度：100C d）脱溶剂气温度：450C.e）脱溶剂气流量：700L/hf）碰撞室压力：0.31Pa（3.1×10mbar）.g）皮质醇激素的特征离子参见表D.3.
8.2雌激素测定
8.2.1雌激素测定液相色谱条件
a）色谱柱：ACQUITYUPLCTMBEHC柱.2.1mm（内径）×100mm.1.7μm，或相当者.b）流动相：A.水：B.乙睛.梯度洗脱，参考梯度条件参见表C.2.c）流速：0.3mL/min. d）柱温：40C，e）进样量：10pL.
8.2.2雌激素测定质谱条件
a）电离源：电喷雾负离子模式， b）毛细管电压：3.0kV.c）源温度：100C.d）脱溶剂气温度：450℃.
