中华人民共和国国家标准
GB/T 22915-2008
口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法
Protocol of universal fluorogenic RT-PCR for foot and mouth disease virus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准参考了世界动物卫生组织（OIE）陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》（第5版）.
本标准的附录A、附录C为规范性附录，附录B为资料性附录.
本标准由中华人民共和国农业部提出.
本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口.
局、中国检验检疫科学研究院. 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫
本标准主要起草人：花群义、杨云庆、秦智锋、周晓黎、卢体康、董俊、陶虹、阮周曦、叶奔优、林祥梅、吴绍强.
口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法
1范围
本标准规定了口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测的操作方法.本标准适用于动物及其动物产品中口蹄疫病毒的检测.
2缩略语
下列缩略语适用于本标准.
荧光反转录-聚合酶链反应.
2.2Cr值每个反应管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数.
2.3 RNA核糖核酸.
2.4 DEPC 焦碳酸磷酯.
2.5 PBS磷酸盐缓冲盐水，配方见附录A.
2.6Tag酶TaqDNA聚合酶.
2.7 FMDV口蹄疫病毒.
3原理
特异性探针.荧光探针的5'端标记FAM荧光素，3'端标记TAMRA荧光素，3'端的淳灭基团在近距离 根据口蹄疫病毒各型共有的基因特定序列的保守片段，合成一对通用的特异性引物和一条通用的内能吸收5'端报告荧光基团发出的荧光信号.但在扩增时，由于Tag酶的5'→3'的外切活性，在延伸到荧光探针时，将其切断，两基团分离，灭作用消失，荧光信号产生.因此，可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测.
4材料与试剂
4.1仪器与器材
4.1.1荧光RT-PCR检测仪.4.1.2高速台式冷冻离心机（离心速度12.000r/min以上）.4.1.3台式离心机（离心速度3000r/min）.4.1.5冰箱（2C~8C和-20C两种）. 4.1.4混匀器.4.1.6微量可调移液器（5pL.10pL.100pL，1000pL)及配套带滤芯吸头.4.1.7Eppendorf管（1.5mL)、透明薄壁PCR管（0.2mL).
GB/T 22915-2008
4.2试剂
4.2.1除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC4.2.2三氯甲烷. 水处理后高压灭菌）分装.4.2.3异丙醇：一20C预冷.4.2.4PBS：配制见附录A.4.2.575%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20C预冷.TCTCCTGTATG-3'.4.2.7荧光双标记探针（10μmol/L）：（FAM）5-CCTCTCCTTTGCACGCCGTGG-3′（TAMRA）.4.2.8口蹄疫病毒通用荧光RT-PCR检测试剂盒：组成、功能及使用注意事项参见附录B.
5抽样
5.1.1下列采样工具应经121C士2C，15min高压灭菌并烘干.5.1.2棉拭子.5.1.3剪刀、镊子. 5.1.4注射器.5. 1.5 1. 5 mL Eppendorf 管.5.1.6研钵.
5.2.1采集的样品主要是口腔、蹄冠上的水泡上皮组织、水泡液、血液、口腔分泌物和组织.采集后立
即冷藏送检或置于含抗生素的PBS缓冲液中低温保藏，编号并作好记录.5.2.2水泡液及水泡皮：用75%酒精轻轻消毒水泡表皮，去掉污物，用灭菌生理盐水擦去酒精，然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液，置于含抗生素的PBS缓冲液灭菌瓶中.水泡液采取后，将水泡皮以无菌术剪下，放人含抗生素的PBS缓冲液中.5.2.3口腔分泌物和咽喉拭子：用拭子采取口腔分泌物或将拭子深入口腔内来回刮3次～5次取分泌 液，拭子一并放人盛有1.0mL含抗生素的PBS缓冲液的1.5mLEppendorf管中.也可用食道探杯刮取咽喉液体，放入加有抗生素的PBS中.编号，冷藏送检或低温保藏.5.2.5肌肉或组织脏器：无菌采集待检样品，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，冷藏送检或低 送检.
温保藏.
5.3样品贴运
样品采集后，放人密闭的塑料袋内（一个采样点的样品，放人一个塑料袋内），于保温箱中加冰、密封，送实验室.
5.4样品制备
5.4.1水泡液、血液和口腔分泌物
样品在混匀器上充分混合后，用经高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转人无菌的1.5mLEppendorf 管中，编号备用.
5.4.2水泡皮、肌肉或组织脏器
取待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mLPBS混匀，4C下3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用.
5.5样本存放
制备的样本在2C～8C条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置一70C以下，但应避免反复冻融（冻融不超过三次）.
6操作方法
6.1实验室标准化设置与管理要求
口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测的实验室规范，见附录C.
6.2样本的处理
6.2.3每管加人600uL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200uL，一份样本换用一个吸头，再加入200pL三氯甲烷，混匀器上振荡混匀5s.于4C、以12000r/min离心15min.
记.吸取6.2.3各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μL，不能吸出中间层，颠倒混匀.
6.2.5于4C、以12000r/min离心15min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒洗涤.
6.2.6于4C、以12000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干.
6.2.7以4 000r/min 离心10s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀 一面，室温干燥3min，不能过于干燥，以免RNA不溶.
6.2.8各管加人11gLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，以2000r/min离心5s，冰上保存备用.提取的RNA应在2h内进行PCR扩增：若需长期保存应放置-70C冰箱.
6.3检测
6.3.1扩增试剂准备
在反应混合物配制区进行.从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，以2000r/min离心5s.设所需荧光RT-PCR检测总数为n（n=u21），其中为被检样品数、2为阳性对照数、1为阴性对照数，按表1配制反应体系混合液.
表1配制反应体系混合液
序号 组分 /吾目基 管总用量/pl1 荧光RT-PCR反应液（2X1 25 n×252 Tag 酶 1 ×13 4 RNA 酶抑制剂(RNasin) RT-PCR反转录酶颗粒 1/2（颗） ×1/2（颗）5 ROX参考染料（ROXreference dye) 1 1× n×16 DEPC水 12 pl. n×12
6.3.2反应体系混合液分装
根据测试样品的数量（n），向配制的反应体系混合液中加人nX1/2颗RT-PCR反转录酶颗粒，充
