中华人民共和国国家标准
GB/T22948-2008
Determination of trimethoprim residues in royal jellyLC-MS-MS method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局.本标准主要起草人：曹彦忠、贾光群、张进杰、石玉秋、王占英、庞国芳.
蜂王浆中三甲氧苄氨密啶残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶残留量液相色谱-串联质谱测定方法.本标准适用于蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定. 本标准的方法检出限为2.0μg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 1-2004 IS 5725-1:1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT）
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987，MOD）
3原理
MCX离子交换柱”或相当的固相萃取柱净化，用氨水-甲醇洗脱并蒸干，残渣用乙-0.1%甲酸水溶液 蜂王浆中残留的三甲氧苄氨嘧啶用去离子水提取，三氯乙酸沉淀蛋白，离心后，上清液经Oasis溶解.样品溶液供液相色谱-申联质谱仪测定，外标法定量.
4试荆和材料
4.1水：GB/T6682，-级. 4.2甲醇：色谱纯.4.3乙腊：色谱纯.4.4三氯乙酸：优级纯.4.5甲酸：优级纯.4.7三氯乙酸溶液：50%（质量分数）.20g三氯乙酸（4.4）溶于20mL水中. 4.6氨水：分析纯.4.82%甲酸溶液：吸取2mL甲酸（4.5）用水稀释至100mL.4.90.1%甲酸溶液：吸取1mL甲酸（4.5）用水稀释至1000ml.4.10流动相：乙晴-0.1%甲酸溶液（713）. 4.11氨水-甲醇溶液（119)：5mL氨水（4.6）与95mL甲醇（4.2）混合均匀.4.12三甲氧苄氨密啶标准物质（CAS：738-70-5）：纯度≥99%4.130.1mg/mL标准储备溶液：准确称取适量的标准物质（4.12），用甲醇配成0.1mg/mL的标准储
1）Oasis MCX离子交换柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果.则可使用这些等效产品.
备溶液，该溶液在4C保存.4.14标准工作溶液；吸取0.1mL标准储备溶液（4.13），移至10mL容量瓶中.用甲醇配成1.0μg/mL的标准工作溶液.该标准工作溶液在4C保存.湿润. 4.15OasisMCX柱或相当者：150mg.6mL.用前依次用5mL甲醇和10mL水活化.保持柱体4.16滤膜；0. 2 μm.
5仪器
5.1液相色谱-中联质谱仪：配有电喷雾离子源. 5.2液体混匀器.5.3振荡器.5.4氮气浓缩仪.5.5分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.6真空泵：真空度应达到80kPa.5.7聚丙烯离心管：50mL 5.8移液器：0.1mL，1mL.5.9玻璃贮液器：50ml.5.10浓缩管：10mL.
6试样制备与保存
6.1试样的制备
对于冷冻的实验室样品，待其解冻后将其搅拌均匀.分出0.5kg作为试样.制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记.
6.2试样的保存
将试样于-18C冷冻保存.
7测定步骤
7.1提取
称取2g试样，精确至0.01g.置于50mL具塞的聚丙烯离心管中，加入20mL水，于液体混匀器（5.2）上快速混匀1min，再置于振荡器（5.3）上振荡提取10min，加人50%三氯乙酸溶液0.5mL，快速摇动0.5min，以3000r/min离心5min，移取上清液至另一离心管中，再向残渣中加人15mL水，重复上述步骤，合并上清液.
7.2净化
将塞有玻璃棉塞的玻璃贮液器（5.9）连到OasisMCX柱（4.15）上，将上清液（7.1）倒人玻璃贮液器（5.9）中，使样液以小于3mL/min的流速通过OasisMCX柱，待样液完全流出后，分别用5mL甲酸溶液（4.8）和5mL甲醇（4.2）洗柱，弃去全部流出液，最后用5mL氨水-甲醇溶液（4.11）洗脱，收集洗脱液于10mL浓缩管（5.10）中.在45C水浴中用氮气浓缩仪（5.4）吹干.准确加人1.0mL流动相（4.10）溶解残渣，样液过0.2m滤膜后，供液相色谱-申联质谱仪测定.
7.3基质标准工作溶液的制备
称取4份阴性样品各2g，精确至0.01g.置于50mL具塞的聚丙烯管中，分别加人4μL、10pL、20 μL、40gL、100μL标准工作溶液（4.14），按7.1和7.2步骤操作.制备成浓度为2.0ng/ml、2
5. 0 ng/mL、10 0 ng/ml.、20. 0 ng/ml. 50 0 ng/mL 的基质标准工作溶液.
7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：Atlantis，3μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；b）流动相：乙晴-0.1%甲酸溶液（713）；c）流速：0.2mL/min;d）柱温：35C；e) 进样量：20pl.
7.4.2质谱参考条件
a) 离子源：电喷雾离子源；b) 扫描方式：正离子扫描；c) (P 电喷雾电压：5500V； 检测方式：多反应监测：e) 雾化气压力：0.076MPa；f) 气帘气压力：0.069MPa；g) 辅助气流速：7L/min； 离子源温度：450C：i）定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表1. h)
表1三甲氧苄氨嘧啶的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压
中文名称 英文名称 定性高子对（/=）定量离子对（m/=） 碰气能量/V 去策电压/V291/230 291/230 35 50三甲氧苄氨嘧啶 triethoprin 291/123 40 50291/275 35 50
7.5液相色谱-串联质谱测定
7.5.1定性测定
时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在土2.5%之内：且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物.
表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示
相对离子丰度 K K>50 20<K<50 10<K<20 K≤10允许最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 7.5.2定量测定 用基质标准工作溶液（7.3）分别进样，以标准峰面积为纵坐标，以标准添加浓度（ng/mL）为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中三甲氧苄氨嘧啶的响应值均应在仪器 测定的线性范围内.在上述色谱条件和质谱条件下，三甲氧苄氨密啶的参考保留时间为2.39min，三甲氧苄氨密啶的标准物质多反应监测（MRM）色谱图参见附录A中的图A.1. 本方法的添加平均回收率数据参见附录B中的表B.1. 7.6平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定. 7.7空白试验 除不称取样品外，均按上述步骤进行.
