中华人民共和国国家标准
GB/T22969-2008
奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素 和卡那霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination of streptomycin dihydrostreptomycin and kanamycinresidues in milk and milk powder-LC-MS-MS method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局.本标准主要起草人：刘晓茂、张守军、张进杰、曹彦忠、曹亚平、杨志伟、庞国芳.
奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素 和卡那霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准适用于奶粉、牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定.
霉素、双氢链霉素和卡那霉素的检出限均为80.0μg/kg. 本标准的方法检出限：牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的检出限均为10.0pg/kg，奶粉中链
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
（2004 ISO 5725-1;1994 1D T)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，1SO5725-2：1994，IDT）
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987，MOD）
3原理
净化.液相色谱-串联质谱仪（ESI十）检测，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯.
4.1水：GB/T6682，一级. 4.2甲醇：色谱纯.4.3乙腊：色谱纯.4.4甲酸.4.5浓磷酸.4.6磷酸氢二钾（KHPO）. 4.7三氯乙酸（CHCIO）.4.8庚烷磺酸钠（CHNaO SHO).4.95%磷酸溶液（119）取50mL浓磷酸（4.5），用水定容至1L，4.100.2mol/L磷酸盐缓冲溶液：pH=8.5.称取34.8g磷酸氢二钾（4.6）用水溶解，定容至1L.用4.11三氯乙酸溶液：50%（质量分数）.取20g三氯乙酸（4.7），用水定容至20mL. 氢氧化钠溶液调节pH=8.5.4.120.01mol/1庚烷磺酸钠溶液：称取2.20g庚烷磺酸钠（4.8），用水溶解，定容至1L.
4.13SPE洗脱溶液：取4 mL甲酸（4.4），用0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液（4.12）定容至100mL.4.1425%甲醇溶液（13）取25mL甲醇（4.2）.用水定容至100ml4.15标准物质：链霉素（CAS：3810-74-0）、双氢链霉素（CAS：128-46-1）和卡那霉素 (CAS：25389-94-0)：纯度均大于等于98%.4.161.0mg/mL标准储备溶液：称取适量的链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准物质（4.15），分别用0.3%乙酸水溶液溶解并配制成1.0mg/mL的标准储备溶液.避光保存于一18C冰柜中.4.170.1μg/mL混合标准溶液：吸取适量链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准储备溶液（4.16），用0.3%乙酸水稀释成0.1μg/mL的混合标准溶液.避光保存于-18C冰柜中. 4.18苯磺酸型固相萃取柱（500mg-3mL）或相当者.使用前依次用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润.4.19羧酸型固相萃取柱（500mg，3mL）或相当者.使用前依次用5mL甲醇和10mL水预处理保4.20滤膜：0.2 yum. 持柱体湿润.
5仪器
5.1液相色谱-中联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源.5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g- 5.3液体混匀器.5.4固相萃取装置.5.5振荡器.5.6真空泵：真空度应达到80kPa.5.7微量注射器；25L 100pl. 5.8pH计：测量精度士0.02pH单位.5.9具塞离心管：100mL.5.10刻度离心管：5ml.5.11贮液器：50mL.5.12离心机：转速4000r/min以上.
6试样的制备与保存
试样置于-18C冰柜，避光保存.
7测定步骤
7.1待测样品溶液的制备
7.1.1牛奶样品提取和初净化
称取牛奶样品8g（精确到0.01g），置于100mL离心管中，加人30mL5%磷酸溶液（4.9），置于振荡器上振荡提取10 min，加入3mL三氯乙酸溶液（4.11)涡旋混合后在4000r/min下离心10 min，上的流速通过萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后，依次用5mL5%磷酸溶液（4.9）和10mL水洗涤苯 清液全部倒人下接苯磺酸型固相萃取柱（4.18）的贮液器中.在固相萃取装置上使样液以小于2mL/min磺酸型固相萃取柱（4.18），弃去全部流出液.用20mL磷酸盐缓冲溶液（4.10）洗脱至50mL离心管中.
7.1.2奶粉样品提取和初净化
称取奶粉样品1g（精确到0.01g），置于100mL离心管中，加入8mL水，涡旋混合后，再加人4000r/min下离心10min，上清液全部倒人下接苯磺酸型固相萃取柱（4.18）的贮液器中，在固相萃取 30mL磷酸溶液（4.9），置于振荡器上振荡提取10min，加人3mL三氯乙酸溶液（4.11）涡旋混合后在装置上使样液以小于2mL/min的流速通过萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后，依次用5mL5%磷酸溶液（4.9）和10mL水洗涤苯磺酸型固相萃取柱（4.18），弃去全部流出液.用20mL磷酸盐缓冲溶液（4.10）洗脱至50mL离心管中.
7.1.3样品溶液再净化
上述洗脱液倒人下接羧酸型固相萃取柱（4.19）的贮液器中，在固相萃取装置上使样液以小于2mL/min的流速通过萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后，依次用10mL水和10mL25%甲醇溶液（4.14）洗涤羧酸型固相萃取柱（4.19）.弃去全部流出液.减压抽干酸型固相萃取柱（4.19）30min.用2mlSPE洗脱液（4.13）洗脱至5mL刻度离心管中.用SPE洗脱液（4.13）定容至2.0mL，混匀后 过0.2um滤膜（4.20），供液相色谱-申联质谱测定.
7.2基质混合标准校准溶液的制备
7.2.1牛奶基质混合标准校准溶液的制备
称取五个阴性牛奶样品10g（精确到0.01g），分别置于100mL具塞离心管中，加人适量混合标准溶液（4.17），制成链霉素、双氢链霉素和卡那霉素含量均为5.0μg/kg、10.0μg/kg、20.0pg/kg、 100.0μg/kg和200.0μg/kg的基质标准溶液.其余按7.1.1和7.1.2步骤操作完成.
7.2.2奶粉基质混合标准校准溶液的制备
称取五个阴性奶粉样品1g（精确到0.01g）.分别置于100mL具塞离心管中，加人适量混合标准800.0μg/kg和1600.0pg/kg的基质标准溶液.其余按7.1.2和7.1.3步骤操作完成. 溶液（4.17），制成链霉素、双氢链霉素和卡那霉素含量均为40.0μg/kg、80.Opμg/kg、160.0pg/kg、
7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：Atlantis C，3.5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者； b）柱温：40C；c）进样量：30gL;d）流动相：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙晴溶液，流动相C为甲醇.梯度洗脱参考条件见表1.
表1液相色谱梯度洗脱参考条件
时间/rsin 流速/（μ1 /min） 流动相A/% 流动相 B/% 流动相C/%0 200 85 10 5200 60 35 56 00 200 60 35 56. 01 200 85 10 516 00 200 85 10 5
7.3.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a）离子源：电喷雾离子源（ESI）； b）扫描方式：正离子扫描：c）检测方式：多反应监测（MRM）；
