中华人民共和国国家标准
GB/T 25221-2010
Inspection of grain and oils-Determination of ergosterol in grainNormal phase high performance liquid chromatography
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.本标准由国家粮食局提出. 本标准由全国粮油标准化技术委员会归口.本标准负责起草单位：国家粮食储备局成都粮食储藏科学研究所、辽宁省粮油检验监测所.本标准主要起草人：何学超、冯永建、姜涛、钟好、肖学彬、王德谦、熊升伟、乔丽娜.
粮油检验粮食中麦角留醇的测定 正相高效液相色谱法
1范围
本标准规定了正相高效液相色谱法测定粮食中麦角留醇的术语和定义、原理、试剂与材料、仪器和设备、扦样、试样制备、操作步骤、结果计算与表示、重复性的要求，
本标准适用于稻谷、小麦、玉米等粮食中麦角留醇的测定.
本方法检出限为0.05mg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB5491粮食、油料检验扦样、分样法
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
3. 1
麦角留醇ergosterol
来源于侵染粮食真菌（孢子或菌丝体）产生的游离麦角留醇和麦角留醇磷酸酯物质，是真菌细胞的正常代谢产物也是真菌细胞膜组成的成分之一.
4原理
试样经皂化后，用正已烷萃取麦角留醇，萃取液经脱水、浓缩和硅胶柱分离后，用高效液相色谱仪紫外检测器在282nm处检测，外标法定量.
5试剂与材料
除非另有规定，试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中三级水要求，色谱用水符合GB/T6682中一级水规定的要求.
5.1正已烷：色谱纯.5.2异丙醇：色谱纯. 5.3正己烷：分析纯，用于提取.5.4氢氧化钾，5.550%氢氧化钾溶液：称取10g氢氧化钾（5.4）.加10mL水溶解.5.6甲醇. 5.72，6-二叔丁基对甲酚（BHT）.5.8维生素C（抗坏血酸）.5.9焦性没食子酸.
GB/T 25221-2010
5.10氯化钠5.11饱和氯化钠溶液：称取316g氯化钠（5.10），加881mL水配制.5.12无水硫酸钠. 5.13流动相：正已烷（5 1）和异丙醇（5.2)[V（正已烷）V（异丙醇）=991].5.14麦角留醇标准品：纯度≥97%.5.15麦角留醇标准储备液：准确称取50mg麦角留醇标准品（5.14），加0.1g抗氧化剂BHT（5.7），用异丙醇（5.2）溶解并定容至50mL，于4C冰箱保存，可保存6个月.5.16麦角留醇标准工作液：根据需要吸取一定量的麦角留醇标准储备液（5.15），用流动相（5.13）稀释 定容配制成适当浓度的标准工作液.5.17滤膜：0.45μm
6仪器和设备
6.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器. 实验室常用仪器设备，以及下列仅器设备：6.2粉碎磨：机内配0.5mm筛片.6.3旋转蒸发器：配150mL梨形瓶.6.4恒温水浴：可控温80℃士1℃. 6.5回流装置：配150mL磨口三角瓶.6.6氮吹仪.
7扦样
样品的扦取和分样按GB5491执行.
8试样制备
试样用粉碎磨（6.2）粉碎，收集全部粉碎物混匀，装于广口瓶中备用.
9操作步骤
9.1提取与净化
称取粉碎试样（第8章）约5g（精确至0.002g）.置于回流装置的150mL磨口三角瓶（6.5）中，加人0.2g抗氧化剂BHT（5.7）、0.6g维生素C（5.8）、2g焦性没食子酸（5.9）和25mL甲醇（5.6），于80℃恒温水浴（6.4）回流5min.从冷凝回流管顶部加5mL50%氢氧化钾溶液（5.5），继续回流30min.回 流结束后，从水浴中取下回流装置，取下冷凝回流管，把已通有氮气流的玻璃管（6.6）迅速插入三角瓶通气约30s，快速塞上瓶塞，于冰水中冷却.再加人55mL饱和氯化钠落液（5.11）和30mL正已烷（5.3），塞上瓶塞剧烈振摇2min.转移到150mL分液漏斗中，静置分层，下层转移至另一个分液漏斗中，用30mL正已烷（5.3）重复提取一次，弃去下层，合并正已烷层.每次用约50mL水洗涤正已烷层，直至洗涤水呈中性为止，将正已烷层经盛有约5g无水硫酸钠（5.12）的漏斗（漏斗中塞一小团脱脂 棉），滤于浓缩瓶中，再用10mL正已烷（5.3）清洗分液漏斗和漏斗，一并滤人梨形浓缩瓶（6.3）中，用旋转蒸发器（6.3）浓缩至小体积后，在氮气流（6.6）下蒸发至干.残渣用10.0mL正己烷（5.1）溶解，用0.45μm滤膜（5.17）过滤，供色谱测定.
9.2色谱参考条件
色谱柱：Inertsil硅胶柱柱长250mm，内径4.6mm，粒度5μm:或性能相当的色谱柱.流动相流速：2.0mL/min.检测波长：282nm.
9.3测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器参数和灵敏度，使麦角留醇峰位与杂质组分峰位完全分离.取20pL试样溶液（9.1）和麦角留醇标准工作液（5.16）（控制标液浓度与样液中麦角留醇的浓度尽量接 近）进样分析，根据峰高或峰面积用单点校正外标法定量.在上述色谐条件下，麦角留醇标准品和试样的色谱图参见图A.1和图A.2.
10结果计算与表示
10.1结果计算
试样中麦角留醇含量（X）以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1）计算：
式中：
（s-麦角留醇标准溶液的浓度，单位为微克每毫升（μg/ml）；V 一试样最终定容体积，单位为毫升（mL)；As-麦角留醇标准溶液对应的峰高或峰面积；m-样品质量，单位为克（g）. A-试样溶液对应的峰高或峰面积；
10.2结果表示
将符合重复性要求的两个独立测定值的算术平均值作为测定结果（mg/kg），保留三位有效数字.
11重复性
在同一实验室，由同一操作者使用相同的设备，按相同的测试方法，在短时间内对样品进行两次独立测定.当测定结果大于3mg/kg时，两个独立测试值的绝对差值应不大于这两个测定值的算术平均值的10%：当测定结果小于或等于3mg/kg时，获得的两个独立测试结果的绝对差值应不大于这两个测定值算术平均值的15%.
