中华人民共和国国家标准
GB/T25876-2010
Method of nested PCRfor sex identification of early cattle embryo
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录B为规范性附录，附录A为资料性附录.本标准由中华人民共和国农业部提出. 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口.本标准起草单位：华中农业大学.本标准主要起草人：张淑君、杨利国、李翔、刘辉、刘文举、胡修忠.
牛早期胚胎性别的鉴定巢式PCR法
1范围
本标准适用于奶牛和肉牛胚胎或胎儿的性别鉴定. 本标准规定了牛早期胚胎性别鉴定的巢式PCR方法.
2规范性引用文件
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
3.1
巢式 PCRnested polymerase chain reaction
利用两套PCR引物（巢式PCR引物对）进行两轮PCR扩增反应，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下，作为DNA模板，进行第二轮扩增.
3.2
SRY基因SRYgene
哺乳动物Y染色体上决定雄性性别的基因.
3珠蛋白基因，位于常染色体上.
4原理
利用巢式PCR反应的敏感性高和特异性强的特性，对少量胚胎细胞的SRY基因片段进行扩增，以HBB基因的扩增作为阳性参照，电泳检测PCR扩增产物根据扩增产物电泳条带鉴定胚胎性别.
5引物
SRY1 5'CTACTCCCCAACCGTCAGAAC 3'5'AGCCCAAACCCATCAACCTA 3′SRY2 5'CCAGGGAACTGCTTGGGTA 3' 5′TGCTTCTCCACTTAGGCTCAA 3′5'TATCCCACTTACAAGGCAGGTT 3'
5'GCAGACAACAGAGAACAAGAATGA 3'
6试剂和仪器
6.1主要试剂
水应符合GB/T6682中灭菌双蒸水的要求.TaqDNA聚合酶及PCR缓冲液、100bp梯度DNA标记物.TE缓冲液、TAE缓冲液、加样缓冲液、溴化乙锭等.具体制备方法参见附录A.
6.2主要仪器
冷冻离心机、梯度PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、pH计、电子天平、恒温水溶锅，双蒸馏水器、微量移液器.
7检测方法
7.1试样的制备与保存
从待检胚胎中分离4个（或4个以上）细胞，用无菌超纯水冲洗3次后，放人0.5mLPCR管中，加人10gL无菌超纯水，100℃C煮沸10min~15min，立即置于碎冰中，冷却后4C离心（8228g）5min，取上清液保存于4℃冰箱中备用.
7.2SRY基因片段PCR扩增
第一次扩增体系为20μL：0.8mmol/L的dNTP、2U的Tag DNA聚合酶、0.2μmol/L的 SRY基因外引物SRY1和内参照引物HBB、10×PCR缓冲液、2.5mmol/L的氯化镁，加适量双蒸水；反应程序为95C预变性5min，94℃变性30s 60C退火30s，72C延伸30s 20个循环结束后，72℃再延钟 10 min 4 “C保温 2 min~10 min.
取第一次PCR扩增产物8pL，作为第二次扩增模板，同时加人10×PCR缓冲液、2.5mmol/L的氯化镁0.8mmol/L的 dNTP 1.6pL，2U 的 Tag DNA聚合酶、0.2μmol/L的 SRY基因内引物SRY2和内参照引物HBB、适量的双蒸水至20μL;反应程序为95C预变性5min，94C变性30s，60℃退火30s，72C延伸30s34个循环后，72℃再延伸10min4C保温2min~10min.
7.3结果判定
取5μLPCR扩增产物，1.0%~1.5%琼脂糖凝胶电泳（3V/cm~5V/cm，电泳20min~30min），澳化乙锭染色，凝胶成像系统检查，电泳图谱见附录B中的图B.1.
谱中只出现558bp条带，判定为雌性胚胎. 电泳图谱中出现558bp（HBB扩增产物）和219bp（SRY扩增产物）条带，判定为雄性胚胎；电泳图
附录A（资料性附录）试剂和材料
表A.1试剂和材料
试剂 配方TE缓冲液 10 mmol/L Tris-HCI pH 8 0) 1 mmol/ L EDT A( pH 8 0)10XPCR缓冲液 20 mmol/L Tris-HCI( pH 8 4):200 mmol/1 氯化钾 100 mmol/1. 硫酸铵 15 mmol/ L 氨化镁琼脂糖电泳缓冲液 1 000mL使用时50倍稀释 242. 28 g Tris 碱，57.1 mL 冰乙酸，100 ml. 0 5 mol/1. EDTA(pH 8 0)-加双蒸水定容至加样缓冲液 0.25%溴酯蓝（质量浓度）-40%蔗糖（质量浓度）溴化乙锭 100mL双蒸水中加人0.1g溴化乙管，搅拌使完全溶解转人棕色试剂瓶钢箔包裹、备用
