中华人民共和国国家标准
GB/T28063-2011
Detection and identification of bean pod mottle virus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局.
本标准主要起草人：廖富荣、沈建国、郑耘、陈青、林石明、陈红运、黄蓬英、吴媛.
菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了藥豆荚斑驳病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法.
本标准适用于可能携带该病毒的豆科作物的种子、苗木等植物繁殖材料的检测鉴定，也适用于传播该病毒介体昆虫的检测鉴定.
2菜豆英斑驳病毒基本信息
中文名：菜豆荚斑驳病毒.
英文名：bean pod mottle virus.
异名：bean podmottle ovirus（菜豆荚斑驳病毒），pod mottle virus（荚斑驳病毒），desmodiumvirus（金钱草病毒）.
英文缩写：BPMV.
属虹豆花叶病毒科Comoviridae、虹豆花叶病毒属Comovirx.
菜豆夹斑驳病毒的其他信息参见附录A.
3方法原理
利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）、反转录和体外DNA扩增技术的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）进行检测鉴定.
4主要仪器设备
本标准的检测鉴定方法主要使用以下仅器设备：
槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计和各种量程的可调移液器（1000ul、200pL、 微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳100 μl 20 μ1 2 μL).
5检测样品的制备
5.1DAS-ELISA和IC-RT-PCR检测样品的制备
对每批送检样品进行症状检查，优先选取具有褐色或黑色斑驳症状的种子（从种脐开始），或者选取具有斑驳、皱缩、褪绿等症状的叶片.
样品提取缓冲液继续研磨. 种子样品：称取0.5g~1.0g的种皮作为检测样品，在液氮中充分研磨，回温后按1：10比例加人
叶片样品：称取0.5g~1.0g的叶片作为检测样品，在研体中研磨或在液氮中研磨，按1：10比例加人样品提取缓冲液继续研磨.
录B）和IC-RT-PCR（见附录C)检测提取液. 把研磨后的样品转移到5mL离心管中，8000r/min离心5min，上清液作为DAS-ELISA（见附
注：提取液在3h内使用，否期保存在4C中.
5.2RT-PCR检测样品的制备
称取表现症状的0.1g叶片、种子等样品在液氮中充分研磨后，利用TRIzol方法提取RNA，（见附录D 中的 D.3)
6检测与鉴定
6.1检测鉴定流程
通常，初筛时采用 DAS-ELISA 检测方法.当DAS-ELISA产生阳性结果时，再采用IC-RT-PCR或RT-PCR等方法进行验证.
当首先采用IC-RT-PCR或RT-PCR方法检测时，如果产生阳性结果，则通过实时荧光RT-PCR方法或序列测定等方法验证.
6.2DAS-ELISA 检测
把制备的样品上清液加入已包被BPMV抗体的在96微孔板中，进行DAS-ELISA检测，每个样品取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如：种子或叶片）应该尽量与所检测样品相一致. 平行加到两个孔中.用健康的植物组织作阴性对照，用感染BPMV的植物组织作阳性对照，用样品提
具体操作过程见附录B.
6.3RT-PCR检测
对照用感染BPMV的植物组织作阳性对照用超纯水作空白对照. 分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增，用健康的植物组织作阴性
具体操作过程见附录D.
6.4IC-RT-PCR 检测
把制备的样品上清液加入已包被BPMV抗体的离心管中然后进行RT-PCR扩增.用健康的植物组织作阴性对照，用感染BPMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照.
具体操作过程见附录C.
6.5序列测定
将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者直接测序，测序可由生物公司完成.把测序所得到的核昔酸序列翻译成氨基酸后与已知的BPMV相应序列进行比对，如果与已知的BPMV相应序列同源性 大于75%则判定为BPMV序列，同源性小于75%则判定为非BPMV序列.
注：序列比对可利用 NCBI 网站上的 BLAST 款件进行，网址为 hrtp:// ncbi nlm. nih gov/BLAST/
7结果判定与报告
7.1结果判定
当DAS-ELISA检测、IC-RT-PCR（或RT-PCR）检测、其中两种方法的检测结果呈阳性时，则判定为检出BPMV；
当IC-RT-PCR或RT-PCR检测结果呈阳性，测定的序列为BPMV序列时，则判定为检出BPMV.
7.2结果记录与保存
记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等.DAS-ELISA检测结果保存吸光值的数据报告，IC-RT-PCR或RT-PCR检测结果保存电泳照片，序列测定结果保存测序报告图.
