中华人民共和国国家标准
GB/T28065-2011
地中海实蝇生物芯片检测方法
Biochip detection of Ceratitis capitata (Wiedemann）
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口
本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局，本元正阳基因有限公司、深圳市检验检疫科学研究院.
本标准主要起草人：余道坚、李建光、任鲁风、徐浪、周琦、章桂明、陈枝楠、汪万春、康林、仲建忠、向才玉.
地中海实蝇生物芯片检测方法
1范围
本标准确定了地中海实蝇Cerazizis capitara（Wiedemann）（双翅目 Diptera实蝇科Tephritidae）的生物芯片制备、检测和结果判定方法.
本标准适用于相关贸易和有害生物监测中地中海实蝇卵、幼虫、蝇的鉴定和成虫的鉴定或复核.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
SN/T2039地中海实巍检疫鉴定方法PCR法
3缩略语
SN/T2039界定的缩略语适用于本文件.
4方法原理
选择实蝇科昆虫线粒体DNACOI基因核苷酸片段为分子标记探针，将探针按预先设置的排列固定于特定的固相支持载体（如：醛基化基片）的表面形成微点阵，利用反向固相杂交技术，用Cy3标记脱氧胞昔三磷酸（Cy3-dCTP）荧光标记的样品分子与微点阵上的探针杂交，实现多个分子之间的杂交反 应，并通过芯片扫描信号的判读来检测样品中特定基因片段的存在，最后确定是否为地中海实蝇.
5仅器和用具
拌器. PCR扩增仪、芯片点样仪、芯片扫描仪、离心机、水浴锅、涡靛器、冰箱、电子天平、烘箱、磁力揽
醛基化基片、多孔板、芯片盖片、芯片分隔围栏、芯片粘贴工具、湿盒、杂交盒、计时器、磁柱、芯片架、2L烧杯、15mL离心管、量筒、移液器等.
6试剂
6.1昆虫基因组DNA提取试剂盒.6.2DNA快速纯化/回收试剂盒.6.450%二甲基亚纲（DMSO）. 6.3去离子水，6.50.2%十二烷基磺酸钠（SDS）.6.60.2%硼氢化钠.
6.710×SSPE （20×SSPE;3 mol/L 氯化钠.200 mmol/1. 磷酸二氢钠，25 mmol/L. EDTA pH 7. 4).6.80.3×SSC、0. 06×SSC（20×SSC：3mol/L氯化钠，300 mmol/L 柠橡酸钠）.6.910×PCR缓冲液（Mg²，15mmol/L) 6. 10 dATP dTTP dCTP dGTP (10 pmol/μL).6.11 Cy3-dCTP.6.12 Taq酶6. 13引物（10 pmol/L). 6.14探针（50μmol/L).6.15阳性质粒.6.16乙醇（70%和99.9%）.6.17洗液I(0.3×SSC 0.2% SDS).6.18洗液II（0.06×SSC).
7生物芯片检测方法
7.1样品前处理按照SN/T 2039进行.
7.2基因组DNA制备按照SN/T 2039进行.
7.3生物芯片探针
7.3.1检测探针
检测探针包括以下类型的探针（见A.1）： 实蝇科通用探针；地中海实蝇与纳塔尔实蝇近缘种特异探针：地中海实蝇和非洲芒果实蝇近缘种特异探针：-纳塔尔实蝇C.rox种特异探针； 地中海实蝇种特异探针：--非洲芒果实蝇C.cosyra种特异探针.注1：检测探针是一条20nt~29nt的赛核苷酸；序列为实蝇科昆虫的特异性序列，5*端氨基修饰.注2：实蝇科通用探针能够特异检测实蝇科昆虫近缘种探针能够特异检测相应的两个近缘种地中海实蝇、纳塔尔 实蝇和非洲芒果实蝇种特异性探针分别可特异检测上述三种实.
7.3.2质控探针
质控探针包括以下四种类型探针（见A.2）：
定位点探针；阳性对照探针；阴性对照探针：一空白对照.
7.4芯片制备
7.4.1芯片基片：选择光学级醛基基片.
GB/T 28065-2011
7.4.2探针稀释：探针用50%DMSO落解至终浓度为50μmol/L，按照探针点阵排布顺序，将探针溶液用移液器加人多孔板中.7.4.3点样：用芯片点样仪将探针点至基片上.实蝇芯片探针阵列排布图参见B.1.一张基片四个探 针点阵的示意图参见B.2.注：每个阵列共5行10列第1行和第1列为定位点探针其他探针各设三个重复.每张基片可以根据实际需求点7.4.4水合：基片置湿盒（内盛三分之一体积水），在烘箱37℃水合12h. 1个或多个相同探针点阵.7.4.5固定：将基片放在芯片架上，置盛有0.2%SDS溶液的烧杯中磁力搅拌漂洗5min.取出再放人盛有去离子水的烧杯中磁力搅拌漂洗3次，每次2min.注：漂洗时溶液应没过基片，洗涤时应在洗液中加人磁柱，打开磁力搅拌器搅择：每漂洗一次，更换去离子水.7.4.6封闭：将固定的基片放人盛有0.2%NaBH，封闭液的烧杯中先磁力搅拌漂洗5min，关闭磁力 搅拌器，静置5min，再磁力搅拌漂洗5min：最后用去离子水磁力搅拌漂洗3次，每次2min7.4.7质检：基片置15mL离心管中.2000r/min离心2min除去水分：用芯片扫错仪对基片进行预扫描质检，质检合格后芯片避光冷藏保存.
注：基片表面无残余固定剂，探针阵列完整，定位点清晰的为合格的芯片.
7.5荧光标记PCR
荧光标记PCR反应在常规PCR仪上进行，引物P.和P：序列见C.1.标记PCR反应体系见C.2.扩增条件：94C90s;94℃C30s55C30s.72C30s 30个循环：72C5min.待测样品模板DNA和 实巍阳性质粒平行进行荧光标记PCR，阳性质粒基因序列见C.3.
注：阳性质粒是一段人工合成的DNA片段，其5'端和3”端核苷酸序列分别为引物P 和P:的互补链.
7.6杂交反应
7.6.1杂交液预热
10XSSPE芯片杂交液在水溶锅中预热至50℃.
7.6.2变性
个灭菌的50μL离心管中，涡旋混匀，在PCR仪上95C变性5min，
7.6.3杂交
盖上芯片盖片，取变性后的产物20uL加人点样区，芯片用锡箔纸包装，置湿盒中在烘箱46C避光杂交3h.
7.6.4清洗
杂交后的芯片依次在42C预热的洗液1、洗液Ⅱ中磁力搅拌清洗2min.
7.6.5离心
芯片置15mL离心管中，2000r/min离心2min除去水分.
7.7芯片扫描
件获得探针阵列的荧光数据. 杂交后的芯片用芯片扫描仪在远红外光区532nm处进行扫描，PMT值设为800.通过扫描仪软
注：芯片扫摧结果存人计算机，扫捕后芯片避光室银保存.
