中华人民共和国国家标准
GB/T 28071-2011
Detection and identification of cucumber green mottle mosaic virus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院.
本标准主要起草人：陈青、陈红运、廖富荣、林石明、吴冰冰、冯黎霞、张永江.
黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法.本标准适用于可能携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的种子、苗木及其产品的检疫鉴定，
2黄瓜绿斑驳花叶病毒基本信息
中文名：黄瓜绿斑驳花叶病毒.
学名:cucumber green mottle mosaie virus.
缩写：CGMMV.
属烟草花叶病毒属Tobamooirus成员.
CGMMV可通过接触传播，也可通过种子传播.蚜虫等常见瓜类病毒的传播介体不能传播CGMMV.嫁接等农事操作是田间病害流行的主要因素之一，植株一旦发病，如果未进行条灭处理，土壤也可带毒，带毒土壤也可成为病害发生的侵染源.
黄瓜绿斑驳花叶病毒的其他信息参见附录A.
3方法原理
通过基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）、体外反转录和体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），并根据生物学特性进行检测鉴定.
4仪器设备、用具及试剂
4.1仪器设备
洗板机、酶联检测仅、高速冷冻离心机、电子天平（感量0.001g）、超净工作台、旋涡混合仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅.
4.2用具
光化学PCR反应板、酶联板、研钵.
4.3试剂
4.3.1酶联测定试剂（见附录B）. 4.3.2RT-PCR检测试剂（见附录C）.4.3.3实时荧光RT-PCR检测试剂（见附录D).4.3.4生物学测定（参见附录E）.
5样品制备
5.1种子样品制备及检疫鉴定
的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号，采集的叶片分成两份，分别用于酶联测定 挑取500粒种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，待长出3片～4片叶后将表现症状和分子生物学检测.
也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测.
5.2苗木检验鉴定
有症状的苗本单独检测.没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同5.1.
5.3植物产品的检验鉴定
品，应按比例取样，检测方法为酶联测定和分子生物学检测. 植物产品有症状的部分（如：果实上的畸形、斑驳等）单独检测.没有症状或无法观察症状的植物产
6检测方法
6.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定
样品平行加到两个孔中.健康的植物组织作阴性对照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，样品提 把制备的样品上清液加入已包被CGMMV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测.每个取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如种子或叶片）应尽量与检测样品一致.
具体操作见附录 B.
6.2RT-PCR检测
分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增.健康的植物组织作阴性对照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照.
具体操作见附录C.
6.3实时荧光RT-PCR检测
分别提取样品和对照的总RNA，进行实时荧光RT-PCR检测.健康的植物组织作阴性对照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照.
具体操作见附录D.
6.4生物学接种试验
参见附录E.
7结果判定
6.1、6.2、6.3、6.4中如果两种方法的检测结果为阳性，即可判断该批种子或苗木携带黄瓜绿斑驳花叶病毒.一般是酶联测定为阳性后，RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性即可判断为携带黄瓜绿斑驳花叶病毒，必要时可进行生物接种试验.
8样品保存
经检验确定携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4℃，病株在一20C或者一80℃冰箱中保存，做好标记和登记工作.
9结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和检测人员的签字.酶联测定应有酶联板反应原始数据，RT-PCR检测应有扩增结果图片，生物学接种应有症状照片.
