中华人民共和国国家标准
GB/T28075-2011
Detection and identification of Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola(Burkholder) Gardan et al.
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准使用重新起草法参考国际种子检验协会（lnternational Seed Testing Association，ISTA）的SeedHealthTesting Methods第7-023号标准《豌豆中萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的检测》编制，与7-023：2008标准的一致性程度为非等效.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
疫局. 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检
本标准主要起草人：林石明、陈青、黄蓬英、易建平、廖富荣、吴媛、陈红运、王宏毅.
萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型 检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了萨氏假单胞杆菌莱豆生致病型的生物学、血清学和分子生物学的检测鉴定方法.本标准适用于植物种子、苗木等繁殖材料及其产品中萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的检测与鉴定.
2萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型基本信息
中文名：萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型（菜豆晕疫病菌）.
学名：Pseudomonas sumustanoi pv.phaseolicola(Burkholder，1926） Gardan，Bollet、AbuGhorrah Grimont &. Grimont 1992
病害英文名：halo blight of bean
同物异名 : Bacterium medicaginis var. phaseolicofa(Burkholder) Link &. Hull 1927Bacterium puerariae Hedges 1927Ph ytomonas medicaginis (Sackett) var. phaseoficola Burkholder 1926Phytomonas puerariae( Hedges)Bergey et al. 1930Pseudomonus medicaginis var. phaseolicola( Burkholder)Stapp &. Kotte. 1929 Pseudomonas mredicaginis f. sp. phaseolicola(Burkholder) Dowson 1957Psendomonas medicaginis Burkholder 1926Pseudomonas phaseolicofα Burkholder) Dowson 1943Pseudomonas syringae py. phaxeolicola(Burkholder) Young Dye &. Wilkie 1978
Xanthomonas medicaginis var. phaseolicola(Burkholder) Elliot 1951
属原核生物界Procaryotes、变形细菌门 Proteobacteria、Y-变形细菌纲Gammaproteobacteria、假单胞杆菌目 Pseudomonadales、假单胞杆菌科 Pseudomonadaceae、假单胞杆菌属Psendomonas.
萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的其他信息参见附录A.
3方法原理
依据病菌在培养基上生长的菌落形态、碳源的利用情况、基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）、基于体外DNA合成技术的聚合酶链式反应（PCR）以及病菌接种后的致病特征等进行检测鉴定，
4主要试剂
本标准的检测鉴定方法主要使用以下试剂：
（菌）酮或制霉菌素、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、Tris-盐酸、EDTA、SDS（十二烷基硫酸钠）、CTAB（十 蛋白陈、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、蔗糖、酪胺酸、甘油、硼酸、头孢氨苄、万古霉素、溴酚蓝、放线六烷基三甲基溴化胺）、溴化乙锭等PCR相关试剂.
5主要仅器
本标准的检测鉴定方法主要使用以下仅器设备：超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、培养箱、电子天平、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、BIOLOG微生物鉴定仪、酶标仪.
6病菌分离
6.1种子样品的制备
品至少检测2000粒种子.根据检测种子样品的质量（g），按照1：1.5（质量：体积）的比例，在样品种 检查种子表面的为害状与异常情况，感病豆荚的种子可能皱缩种皮有奶黄色的斑块.每份检测样子中加人无菌蒸馏水，如500g种子则加人750mL：于4℃~5℃下静置12h~18h.取种子浸出液10mL，用15550g离心5min，用蒸馏水分2次（每次1mL）洗下沉淀物，制成种子浸出液.
6.2种子中病菌的分离培养
取100μL的种子浸出液涂布于MT和（或）MSP培养基平板（培养基的配制见附录B）.每个处理至少3个~5个重复，无菌水作为空白对照.
在27C土2C下培养，3d后开始观察，发现可疑菌落（菌落形态特征见6.4），将菌落转移至KB平板上培养1d~2d（培养基的配制见附录B)，纯化3次后进行生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR等方法鉴定.
6.3植物组织中病菌的分离培养
仔细检查症状（参见图A.7），用无菌刀片将感染组织切成细的切块，加一滴无菌水置于载玻片上，然后盖上盖玻片在显微镜下观察细菌的菌滕.如有，直接蘸取菌脓，或将菌转移人1mL无菌水中，在MT和（或）MSP平板上划线分离（培养基的配制见附录B）.
选择新鲜症状的叶片、豆荚等组织，切取病斑前沿部分2mm~7mm的组织，用70%酒精表面消毒15s，无菌水洗2次~3次在MT和（或）MSP平板上培养.
在27C土2℃下培养，3d后开始观察，发现可疑菌落（菌落形态特征见6.4），将菌落转移至KB平板上培养1d~2d(培养基的配制见附录B)，纯化3次后进行生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR等方法鉴定.
6.4菌落形态特征
产生，并进行革兰氏染色及鞭毛染色.菌落在以下培养基上产生如下特征，可以确定可疑菌落. 可疑菌落在KB培养基上划区培养至少20个菌落，在28℃下培养24h~48h，观察有无荧光色素
在MSP培养基上：Psph菌落圆形、隆起、球形、发亮、淡黄色、中央略浅.3d后，菌落边缘的培养基变成淡黄色（参见图A.6）.
菌落产生淡蓝色的荧光（参见图A.7）.
在KB培养基上：Psph的菌落扁平、乳白色和奶油状：3d后，产生蓝绿色荧光.
丁香假单胞杆菌丁香致病型（Pseonomonas syringae pv.syringae）的一些菌株与Psph一样，在MSP培养基上培养3d后，菌落边缘的培养基也变成淡黄色，但是，Psph的菌落边缘不整齐.
7病菌签定
7.1生化鉴定
采用BIOLOG微生物鉴定仅对可疑菌落进行生化鉴定.
7.2DAS-ELISA方法
一次.用已知菌株作阳性对照，用缓冲液作空白对照. 将可疑菌落配制成10CFU/mL悬浮液，取100pL悬浮液作为检测样品.每个检测样品重复
具体操作步骤见附录C.
7.3PCR方法
中（培养基配制见附录B），在25C士2℃C下振荡培养过夜，离心后提取沉淀的DNA，进行PCR扩增. 将可疑菌落制备成10CFU/mL的细菌悬浮液，进行PCR扩增，或者把可疑菌落转到NB培养基用已知菌株作阳性对照，用无菌水作空白对照.
具体操作步骤见附录D.
7.4致病性测试
7.4.1概述
如果生化鉴定、或DAS-ELISA、或PCR方法中一种或一种以上方法的检测结果产生阳性，则进行致病性测试以确认鉴定结果.致病性测定采用以下针刺接种法或浸泡接种法.
7.4.2针刺接种
用牙签或解剖针取在KB培养基上有蓝绿荧光的纯化菌落，在弯颈期的小苗上剩伤接种子叶的近胚轴面，用无菌水接种叶片作空白对照.最少接种10个菌落，每个可疑的菌落接种10株以上小苗，每株接种至少2个接种点.每次接种前，牙签或解剖针都要消毒.
接种4d~5d后，子叶内部可以见到典型的“油脂"状斑点.如果8d~10d后没有出现症状，则可判定为非致病菌.
7.4.3浸泡接种
将感病品种的种子播种在苗床或吸水纸上，保湿，25C黑暗条件下培养2d.
可疑菌落在KB上培养1d~2d后，用无菌水配制成10CFU/mL的悬浮液.
用解副针挑开已充分吸水种子的子叶和种皮，在悬浮液中浸泡10min~15min.每个可疑菌落接5 d-7 d 种10粒以上种子.设无菌水作空白对照.将浸泡后的种子种植在无菌的土壤中，20℃下高湿培养
种子萌发后，在子叶上出现油脂状”的斑点，第一真叶也可能出现症状.如果8d~10d后没有出现症状，则可判定为非致病菌.
8结果判定与检测报告
8.1结果判定
8.1.1未分离到可疑菌落
如果经MT或MSP培养基分离培养，7d后仍未产生可疑菌落，则未检出萨氏假单胞杆菌菜豆生
