T/SAASS 体 标 准
T/SAASS328-2026
Technical code of practice for genetic integrity testing of cultivated soybeangermplasm
山东农学会 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由山东省农业科学院提出.
本文件由山东农学会归口.
本文件起草单位：山东省农业科学院.
本文件主要起草人：王栋、李娜娜、夏晗、杨永义、李润芳、宫永超.
栽培大豆种质遗传完整性检测技术规程
1范围
本文件规定了栽培大豆种质遗传完整性检测的不同生活力群体的获取、SSR标记分析、结果统计与判定方法等技术要求.
本文件适用于大豆种质遗传完整性的检测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T3543.4农作物种子检验规程第4部分：播种质量发芽试验
GB4404.2粮食作物种子第2部分：豆类
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
遗传完整性geneticintegrity
频率分布及各位点等位基因频率分布和其原始群体一致. 种质原始遗传组成状态，即在繁殖保存过程中要使其群体的遗传结构得到完全的保持，包括基因型
3.2
种质遗传完整性变化changesingeneticintegrityofgermplasm
种质贮藏过程中的遗传变化以及种质繁殖后其后代群体的遗传组成与亲代种质群体相比较发生了变化.
3.3
遗传多样性指数geneticdiversityindex
用于量化一个种群或物种内部遗传变异丰富程度和分布均匀程度的数学指标，指数越高表明明遗传多样性越丰富.
3.4
香农指数shannonindex
用于衡量遗传多样性或种群内基因多样性的指标，它量化了种群中不同基因型或等位基因的丰富度和均匀度，指数值越高，说明种群内的遗传多样性越丰富，基因分布越均匀.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.SSR：简单重复序列（Simple Sequence Vepeat） PCR：聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）
5不同生活力群体的获取
5.1材料准备
以播种、田间管理、收获及成熟度一致的大豆种子为试验材料，至少5000粒种子.大豆种子质量应符合GB4404.2的要求.
5.2平衡含水量
间为15d，测定种子含水量，直至7.3%～7.5%，若种子含水量达不到此标准，相同条件下继续平衡. 将大豆种子放入人工气候箱中进行种子含水量平衡，平衡条件是相对湿度为45%，温度为25℃，时
5.3密封包装
将大豆种子平均分成若干份，每份用铝箔袋真空密封包装，即为一个处理群体，约500粒.每个处理群体将用于之后的生活力检测、繁殖更新和SSR标记分析.
5.4人工老化
采用倒序法进行人工老化，每隔2周进行一个处理群体的人工老化试验，将铝箔袋密封包装后的大豆种子放置于人工老化箱内恒温老化，温度为40℃，试验结束时处理群体一起取出，以未经过老化 的处理群体作为对照，人工老化时间视大豆种质及所需的生活力梯度面定.
5.5含水量再平衡
人工老化结束后，在25℃下将处理群体密封平衡2d，可获得大豆不同生活力的亲代群体.
5.6亲代生活力检测
亲代群体的发芽试验应按照GB/T3543.4的规定执行，并统计每个群体的发芽势、发芽率、发芽指
数和活力指数等生活力指标.
5.7亲代繁殖更新
将不同生活力亲代群体的大豆进行田间繁殖更新，每个群体定植200株，并进行单株编号，得到其
繁殖后代群体.
5.8繁殖后代生活力检测
体的每个单株也进行编号，编号与其亲代单株是一一对应关系.对繁殖后代群体的发芽试验应按照GB/T3543.4的规定执行，并统计每个群体的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数等生活力指标.
6SSR标记分析
6.1处理样本
从亲代及繁殖后代每个生活力群体中选取96个单株，采集幼嫩叶片，-80℃下保存备用.
6.2提取基因组DNA
单株提取上述大豆种质亲代及繁殖后代各个群体的基因组DNA.提取步骤为：
a）将大豆幼嫩叶片用镊子放入2.0ml离心管中，每管加入一粒直径5mm的钢珠后，进行下一步b）将离心管迅速放入液氮中冷却，装入组织研磨仪中将叶片打碎，时间为30s，频率为50Hz， 操作或-80℃备用：注意动作要迅速，之后取出离心管加入1mL的SDS提取液，提取液事先放入65C水浴中预热，抑制DNA酶，加速蛋白质变性，促进DNA溶解，然后向离心管中加入10uL的疏基乙醇，抑制c）将离心管放入65C水浴中保温1h，水浴过程中每10min摇动一次： 酚氧化为醒，充分混匀，也可剧烈震荡：d）待样品冷却至室温后.加入1/5体积的5MKAc，冰水混合物中放置30min：e）12000g离心10min后，吸取1000gL上清液加入到另一2.0mlL离心管中，在每管中加入等体 积的苯酚/氯仿/异戊醇溶液，体积比为25：24：1，充分振动15min后，12000g离心15min：
f) 吸取800uL上清液加入到另一2.0mL离心管中，加入10uLRNA酶（10mg/μL）溶液，37Ce 每管中加入800uL的氯仿/异戊醇溶液，体积比为24：1，充分振动15min后，12000g离心 水浴1h或-4C过夜：15min:h) 吸取600uL上清液加入到另一2.0ml离心管中，每管加入0.6~1.0体积的异丙醇，轻轻混 匀后置于-20C下30min，12000g离心10min，收集沉淀：i） 加入1mL75%乙醇冲洗2次后，再用1mL无水乙醇冲洗1次，置于真空离心机中，将DNA吹干至无酒精味，加入100giL1XTE溶解：j） 样品在4C备用，多余样品置于-20℃下长期保存： 提取完成后，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性（要求条带清晰、无明显拖尾）：采用核酸蛋白测定仪检测浓度（要求DNA浓度为50ng/uLl~200ng/μL）和纯度（OD260/0D280比值为1.8~2.0），不符合标准的样本需重新提取.
6.3SSR核心引物筛选
以对照群体的96个单株基因组DNA为模板，用大豆SSR引物进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测、银染显色及统计结果分析.根据每对引物在96个单株中的扩增结果，剔除不具备多态性或多态性较低的引物，即期望杂合度低于0.5的引物，最终筛选获得20对高多态性核心引物.引物信息见表1.
表1大豆遗传完整性分析SSR核心引物表
序号 引物编号 正向序列 GCGACATTATTGTTTGGATAGTAAGATT 引物序列 PCR产物大小 259 连锁群1 Satt382 反向序列 GCGCGATTCTTTTAAACAATTCAAACAC 259 A1Satt387 正向序列 GOGTTACGTITCACTATTTATTTAACAT 214~238 A2反向序列 GOGGCAGGCTAGCTACATCAAGAG 214~2383 Satt509 正向序列 GCGCTACCGTGTGGTGGTGTGCTACCT 238 B1反向序列 正向序列 CTCCTCCTGCGCAACAACAATA GCGCAAGTGGCCAGCTCATCTATT 1884 Satt534 反向序列 GGGGGATCTAGGCCATGAC 188 B25 Satt338 正向序列 GCGCCCAAGTATTATGAGATATTTGAT 250 C1反向序列 GCGATAATTTTAAAACTGGACCA 2506 Satt460 正向序列 反向序列 GCGCGATGGGCTGTTGGTTITTAT GOGCATACGATTTGGCATTITTCTATTG 156 156 C2正向序列 GGGATTAGGTTTATGGAAGTTTATTAT 1807 Satt179 反向序列 GGGTCATTAAAACGATCAGTAAGA 180 D1a8 Satt542 正向序列 CACCAGCACAGAACAATCATTT 205 D1b反向序列 CACGGTCTAACCTTTCCTTCTA 2059 Satt443 正向序列 反向序列 AACTCCTCATACCTCTCTCTCTC GCGACTTAGGGTCCTAGATCCATA 235 235 D2正向序列 GCGGATTTCGATTTGAATATACTTAC 16710 Satt573 反向序列 CCTGTGGCTGTTATACTATGCATATA 167 E11 Sat_234 正向序列 GCGATGCGTTTAATAAGTTTTGAAAAATGCC 332 F反向序列 正向序列 GCGGAAACCATCCTTATATGTCAATTGCTCA GCGAATGTATTTTTGTTTCTCCATCAA 33212 Satt352 反向序列 TGATAAGCCAAAAAATGGAAGCATAG 183~195 183~196 G
