中华人民共和国国家标准
GB/T28979-2012
欧芹壳针孢检疫鉴定方法
Detection and identificationofSeptoria petroselini
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局检验检疫技术中心.本标准主要起草人：林石明、廖富荣、陈青、黄蓬英、陈红运、王宏毅、吴媛.
欧芹壳针孢检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了欧芹壳针孢的检测和鉴定方法，本标准适用于欧芹属种子、苗木及其产品中欧芹壳针孢的检测和鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T18085-2000植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法SN/T1809进出境植物种子检疫规程 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3欧芹壳针孢基本信息
拉T学名：Septoria petroselini（Libert）Desmazieres
中文名称：欧芹壳针孢
属真菌界（Fungi），无性真菌门（Anamorphic fungi），未分目（曾归为球壳孢目Sphaeropsidales），未分科（曾归为球壳孢科Sphaeropsidaceae），壳针孢属（Septoria）.至今尚未发现其有性阶段.
叶斑病.该病菌主要通过感染的种子进行远距离传播，种子是重要的初侵染源. 欧芹壳针孢自然侵染欧芹（Petroxelinumcrispum）和芜要（Coriandrnm sativwm），引起欧芹壳针孢
欧芹壳针孢的其他相关信息参见附录A.
4方法原理
本标准通过分离培养，根据菌落形态特征，病原菌无性世代的分生孢子器、分生孢子梗和分生孢子的形态特征，结合病菌所引起的主要危害症状，对该病原进行鉴定.
5主要试剂、仪器设备和用具
5.1主要试剂
次氯酸钠，蔗糖，甘油，琼脂，酒精等.
5.2仪器设备
超净工作台，高压灭菌锅，光照培养箱，生物显微镜（20×～400×）等.
5.3用具
白瓷盘，培养Ⅲ，酒精灯，吸水纸，载玻片，盖玻片，刀片，手术剪，镊子，尖头锻子，刷子，pH计，血球
计数板，塑料袋，离心管等.
6抽样与检查
按 SN/T1809或SN/T2122规定的抽样方法进行抽样检查.
检查种子、苗木及其产品是否有病斑、小黑点（分生孢子器）等（参见附录A）.若有小黑点，直接切片在显微镜下检查.受感染的叶片初为黄色小斑，随后变成浅黄色至黄褐色，最后为褐色的病斑.病斑边缘额色稍深，为坏死周.病斑圆形至长圆球形，或不规则，平均3mm~8mm，最大的直径约13mm，边缘具窄的褐色的坏死线.在叶柄上为卵圆形、暗褐色的小病斑，叶面上病斑产生黑色小点（即分生孢 子器）.在种子表面具黑色小病斑或小黑点.
7病菌分离
7.1植物组织中病菌的分离
PDA培养基上，于20℃~25℃下培养3d~5d后，挑取菌落边缘菌丝进行纯化. 将植物组织用1%的次氯酸钠消毒2min～5min，用无菌蒸馏水冲洗，在无菌条件下晾干，放置在
7.2种子中病菌的分离
7.2.1洗涤检查
称取50g或适量的种子，加无菌水100mL，在振荡器中振荡5min，取洗涤液在1000r/min离心3min，弃上清液在沉淀中加入适量（约1mL）的席尔氏液（配制方法见GB/T18085-2000的附录A）悬浮，取1滴（约50pL）的悬浮液在显微镜下（20×~400×）检查.
7.2.2分离增养
检查异常的种子，挑取表面具有小黑点的种子，或随机挑取种子，每份样品至少检测400粒种子.用蒸馏水将吸水纸充分湿润（避免产生多余的水），种子均匀置于吸水纸或PDA培养基上（如直径9cm的培养Ⅲ约25粒/ⅢL），加盖后，在20°C~22°C，在12h紫外光和12h黑暗下交替培养.或者先在
8病菌整定
8.1形态特征
8.1.1在PDA培养基上（见附录B)，菌落糠税状，呈暗褐色（参见图A.3）.从病组织或分离纯化所得 的菌落挑取的分生孢子器，在立体显微镜下进行形态观察和切片（最好能够从孔口处切开），根据分生孢子器、分生孢子梗和分生孢子的形态特征进行鉴定.
8.1.2分生孢子器埋生于表皮下或稍微突出，单室，球形至近球形，有些较扁，黄色至黑褐色，直径55pm~200μm:具近网形至椭圆形孔口.直径20ym~40pm.分生孢子器壁由多角形的厚壁细胞所组成，厚壁细胞直径为3pm～5pm，黄色至福色.分生孢子梗短，瓶梗形，无色透明，从分生孢子器的 内壁伸出，产孢方式为全壁芽生合轴式.分生孢子具0～4个真隔膜，一般为1～3个隔膜，未成熟的可能没有隔膜，无色透明，线状或近圆柱形，（1.0m~1.5gm）×（22μm~51μm），长宽比例大于10，通常稍微弯曲，基部钝圆而顶部渐尖.参见图A.4~图A.6.
8.2致病性测定
8.2.1接种体制备
刮取在PDA培养3d的可疑菌落的分生孢子，用无菌水配制成10CFU/mL~10CFU/mL孢子悬浮液.
8.2.2接种试验
将欧芹种子播种于小盆钵中，每盆插种5～8粒种子，生长5周～7周，备用.用刷子轻扫欧芹幼苗叶片进行创伤，将孢子悬浮液喷雾接种于欧芹的叶片上每盆接种5株，重复二次.用无菌水作空白对20℃下黑暗中培养48h后，去掉塑料袋，在65%~70%的相对湿度下，移入培养箱，20°C~25℃下黑 照.如可能，采用欧芹壳针孢已知菌株作阳性对照，接种后用干净的塑料袋包扎封口，在饱和湿度，于暗中培养；注意观察，一般在14d后就产生典型的症状.
9结果判定与样品保存
9.1结果判定
9.1.1未分离到可疑菌落
病菌分离培养7d后，仍未产生可疑菌落，则未检出.
9.1.2分离到可疑菌落
分离培养后的可疑菌落，其形态特征如果符合8.1描述的鉴定特征，经致病性接种试验又产生典型的症状，面空自对照没有表现症状，则判定为检出：可疑菌落没有产生典型的症状，则判定为未检出.
9.2记录及样品保存
检测报告应包含所采用的病菌分离方法，包括菌落形态特征、致病性测定所产生的症状照片等，供试样品和所分离到的菌种，应保存在低温冰箱中，以备复核.
