中华人民共和国国家标准
GB/T31730-2015
Detection of genetically modified ponents in rice-Membrane-based array method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由中国标准化研究院归口.
本标准起草单位：四川华汉三创生物科技有限公司、中国标准化研究院、黑龙江省粮油卫生检验监测站.
本标准主要起草人：黄广平、云振宇、尹志坚、胡太贵、孙昭、张瑶、王勇强、董玖红、宋廷瑞、张金龙、刘页.
水稻中转基因成分测定膜芯片法
1范围
本标准规定了水稻及水稻加工产品中转基因成分的检测方法.
本标准适用于转BAR基因耐除草剂水稻和转Bt基因（Cry1Ab/Cry1Ac)抗虫水稻中转基因成分的快速定性检测，也适用于水稻加工产品中以上成分的快速定性检测.
本标准规定的转基因成分最低检测限量是1g/kg.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.6转基因产品检测基因芯片检测方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
GB/T19495.1、GB/T19495.6界定的术语和定义适用于本文件.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleie acid) dNTP：脱氧核书酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate)dATP：脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)dCTP：脱氧胞甘三磷酸（deoxycytidine triphosphate)dGTP：脱氧鸟书三磷酸（deoxyguanosine triphosphate)dTTP:脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate) dUTP：脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate)
bp:碱基对(base pair)
BAR：草丁腾乙能转移酶基因(phosphinothricin acetyltransferase gene)
Cry1Ab：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cryIA（b）基因[Bacillas tharingiensis insecticidal toxincryIA (b) gene]
Cry1Ae:苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cryIA（c）基因[Bacilus rhuringienasis insecticidal toxincryIA (c) gene)]
CaMV35S-P:花椰菜花叶病毒的35S启动子（promoter from cauliflower mosaicvirus)NOS-3：朋脂碱合成酶基因终止子（termination sequence of the nopaline synthase gene)CaMV35S-T：花椰菜花叶病毒的35S终止子（termination sequence from cauliflower mosaic virus)GOS9;水稻 gos9基因[Oryzα saticu(rice） gos9 gene] PC;阳性对照(positive control)NC：阴性对照(negative control)UNG 酶：尿喀啶-N-糖基化酶（UNG酶）（uracil N-glycosylase)Tag 册 ： Thermacs aquaricus DNA 聚合酶 ( Thermus aquaticus DNA polymerase) AminolinkerC6：6个碳原子作为连接臂的氨基标记（C6 Amino linker）
4原理
根据转基因水稻中常见转基因片段和调控元件设计特异性多重PCR引物，对样本进行多重PCR扩增.PCR引物上修饰有生物素.若样本中出现目标片段而得到PCR扩增产物，PCR产物与固定有 目标基因特异性探针的膜芯片进行杂交，杂交点上的生物素和碱性磷酸酶标记链霉亲和素反应，以及碱性磷酸酶化学显色底物进行化学显色，则可在杂交点上形成肉眼可见的杂交信号.依据膜芯片上杂交点的显色情况，判断样本中是否含有待检转基因成分，检测结果可以用肉眼直接判断，或用芯片识读仪对杂交芯片进行扫描并判定结果.
5试剂与标准品
5.1试剂
5.1.1试剂组分
本标准中试剂组分和存放条件参见附录A和5.1.2~5.1.4的规定.除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水.
5.1.2引物
PCR反应使用的引物序列应符合表1的规定.
表1PCR反应使用的引物序列
目标基因 引物名称 序列 扩增片段大小BAR Forward 5′-CACCTGCTGAAGTCCCTGGA-3* 193 bpReverse 5′-biotin-GTACCGGCAGGCTGAAGTCCA-3*Cry1Ab Forward 5′-GACATGAACAGCGCCTTGAC-3′ 164 bpReverse 5′-biotin-TTGATGGTTGCAGCATCGAA-3′Cry1Ac Forward 5′-GTTAGACTCAACAGCAGTGGA-3′ 161 bpReverse 5'′-biotin-GAGAAGATGGATGAATTACCCCA-3' 5′-GGCCATCGTTGAAGATGCCTC-3*CaMV35S-P Forward Reverse 5′-biotin-TCATCCCTTACGTCAGTGGA-3? 144 bp
表1（续）
目标基因 引物名称 序列 扩增片段大小NOS-3' Forward 5′-TGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT-3′ 113 bpForward Reverse 5 ′-biotin-GCGCGCGATAATTTATCCTAGTTT-3′ 5′-CCAGATAAGGGAATTAGGGTTC-3*CaMV35S-T Reverse 5′-biotir-ACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGA-3' 132 bpForward 5′-GACGATCCGTAGTGGAGC-3'GOS9 Reverse 5′-biotin-GTAATCGTAGTTGGATTTCCACC-3* 117 bp
5.1.3探针
膜芯片表面包被的目标基因探针序列应符合表2的规定.
表2目标基因探针序列
名称 序列 修饰基团BAR 5'-CGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGCTTCAAGCACGGGAACTGGCATGAC- GTGGGTTTCTG-3* 5′- AminolinkerC6Cry1Ab 5′-GCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGG-CAAAGGTGGGG-3 5′- AminolinkerC6Cry1Ac 5′-TCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGGTATGCTTCTGTGACCCCTAT- TCACCTCAACGT-3* S ′- ArminolinkerC65′-AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCA-CaMV35S-P AGTGGATTGATG-3* 5′AminolinkerC6NOS-3' 5'-TTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAA- CAAAATATAGCGC-3 5′-AminolinkerC65′-AGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTT-CaMV35S-T CTATCAATAAAAT-3* 5′- AminolinkerC6GOS9 5′-GCCTTTACATACGTTGGCACGGACGGGAATGAACATCTTGCAGGTCC- 5′-AminolinkerC6TTGGGGTGGTGG-3’PC 5′-GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTG- TCCAAAGTACCAG-3′ 5 '- AminolinkerC65′-GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGAT- 5′-AminolinkerC6NC GATCCTATTTTC-3′注：阳性寨核苷酸单链DNA（Positive-Oligo.10xmol/L）：核苷酸序列与阳性对照核酸探针（PC）序列互补，用于5′-biotin-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3? 膜芯片杂交过程质量控制，5'箱带生物素（biotin）标记，序列如下：
5.1.4其他试剂
5.1.4.1 碱性磷酸酶标记链霉亲和素（AP-streptavidin）.5.1.4.2 碱性磷酸酶化学显色底物5-溴-4-氧-3-吲噪磷酸和氯化硝基四氮唑蓝（BCIP/NBT）.
