中华人民共和国国家标准
GB/T31796-2015
南美大豆猝死综合症病菌和北美大豆 猝死综合症病菌检疫鉴定方法
Detection and identification ofFusarium tucumaniae andFusariumvirguliforme
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局.本标准主要起草人：吴品珊、王颖、章桂明、陈枝.
南美大豆猝死综合症病菌和北美大豆 猝死综合症病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了南美大豆猝死综合症病菌和北美大豆猝死综合症病菌的检疫鉴定方法.本标准适用于田间大豆和大豆粒携带的土壤和病残体中南、北美大豆辨死综合症病菌的鉴定.
2仅器和用具
2.1仪器
生物显微镜、超净工作台、光照培养箱、电子天平（1/1000g）、高压灭菌锅、冰箱、PCR扩增仪、荧光PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅、摇床.
2.2用具
移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐. 烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养Ⅲ、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、接种针、载玻片、盖玻片、塑料研栋、
3试剂和培养基
3.1试剂
琼脂粉，马铃薯，葡萄糖，乳酸，琼脂糖，无菌双蒸水，液氮，蛋白陈，磷酸二氢钾，硫酸镁，链霉素，新霉素，五氯硝基苯，氯四环素，利福平，Tris-HCl，MgCl，HCI，EDTA，NaOH，NaOAc，KCI，Tris，CTAB，TAE，无水乙醇（Ethanol），苯酚（Phenol），溴化乙锭（EB），三氯甲烷（Chloroform），异丙醇（Isopropanol) 异戊醇（Isoamylalcohol)，蛋白酶K，Taq DNA 聚合酶，dNTP DNA 相对分子质量标准物，双重PCR特异性引物Fu1/2和Fsgα-1/2，实时荧光PCR特异性引物及探针16-FP/16-RP和 16-AG Taq Man Universal PCR Master Mix.
3.2培养基
0.2%水琼脂培养液选择性培养基PCNB，马铃薯葡萄糖培养基（PDA），低营养合成培养基（SNA）.具体配方参见附录A.
4检疫整定方法
4.1症状检查
持绿色，根部维管束组织有褐色病变，髓部白色.参见附录A病害症状描述. 南、北美大豆猝死综合症在症状上区别不大，病害典型的症状是叶片的叶肉枯黄坏死，叶脉有时保
采集田间疑似症状大豆植株的根部、植株周围的土壤，备用.在大豆粒中筛选其携带的土壤，并挑选其中混杂的病残体，尤其是大豆的地下部分根，备用.
4.2分离培养
将土壤样品每份取2g放人100mL0.2%的水琼脂培养液中，摇床摇动、混匀20min，用无菌水将5个重复，23℃光照培养，4d~7d后观察菌落的产生情况， 培养液分别稀释10倍和20倍，分别取1mL土壤稀释液涂抹于选择性培养基PCNB平板上.每处理
将病残体切取边长为5mm~10mm的见方小块.70%乙醇表面消毒10s~30s放置在选择性培养基PCNB上，20℃12h光照/12h黑暗培养1周~2周.
4.3形态学鉴定
如在选择性培养基PCNB上观察到真菌菌落的形成，转接到PDA上，20C12h光照/12h黑暗或自然光线下培养，3d～5d后开始观察记录病菌的培养性状，显微镜下观察记录分生孢子的形状和大小，
如PDA上有疑似菌落出现，转到SNA上20C黑暗培养，显微镜下观察记录分生孢子的形状和大小，
4.4分子生物学检测
4.4.1DNA提取
收集分离到的真菌菌丝，采用CTAB方法提取DNA，参见附录B.
4.4.2双重PCR检测
北美大豆猝死综合症病菌（Fusariumvirguliforme）的双重PCR特异性引物为：Ful：5'-GGAGGGATCATTACCGAGTT-3' Fu2; 5′-TTCCAGTTGCGAGGTGTTA-3′' Fsgα-1; 5′-AGTOGACCACCGTAAGTCG-3′ Fsg α2:5′-GATCAGGGCTTTGTCCAAC-3′
反应体系(25 μL);10× PCR 缓冲液3 μL 25mmol/L MgCl2 pL 10 mmol/L dNTP 0.5 pL 10 μmol/L Fu1/2 引物各0.8μL，10 ymol/L Fsgα-1/2 引物各 1.0 yL Taq DNA 聚合酶 1 U，模板 DNA4ng加灭菌双蒸水至25l
反应条件：94℃，5min变性处理后，经30个循环（94℃，1min：55C，30s:72C30s），72C延伸10 min.
1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像系统观察电泳结果.
4.4.3荧光PCR检测
南美大豆猝死综合症病菌（Fusariumtucumaniae）荧光PCR引物及探针序列为：16-FP：CCAGTGGTGCGGAAGGTA 16-RP:GACGGCGATTCCAACAGTAG 16-AG:JUP-ACCCTAGAGCTCGTCTT-JUP.
反应体系（10pL)：实时荧光反应混合液5LTagManUniversalPCRMaster Mix 0.3gL各引物（10μmol/L)，0.3μL探针（10μmol/L)，1μL DNA（10ng/μL)，无菌双蒸水3.1 μL，将反应体系混匀，离心后置于实时荧光PCR仪中进行反应每个反应重复2次，以无菌双蒸水作空白对照，阳性对照以 南美大豆死病菌DNA为模板，阴性对照以大豆上其他镰刀菌DNA为模板.
反应条件为50C预热2min，95℃变性10min，然后进入循环反应：95C变性15s，60℃延神1 min，共40次循环.
5签定特征
5.1培养性状
南、北美大豆猝死综合症病菌在菌落培养形状上区别不大.
南、北美大豆猝死综合症病菌的菌落在选择性培养基PCNB上4d～7d可显现.特征是生长速度较缓慢，直径小，一般为0.5cm~0.9cm；颜色为白色，中心有时为浅黄色突起：形状为圆形、星型或放射状；菌落微隆，表面为粉笔末的颗粒状，较致密，无气生菌丝覆盖.
南、北美大豆猝死综合症病菌在PDA上菌落通常为蓝绿色、灰绿色、浅绿色或蓝色，偶尔黄白色，菌落边缘为灰白色，缺乏气生菌丝，随着菌落的年龄增长，颜色由蓝绿色变化为蓝紫色或深绿色.
5.2病菌形态
南美大豆猝死综合症病菌（F.racammriae）菌丝在SNA上宽1μm~5μm（~14μm），厚垣孢子形成在菌丝和分生孢子上，通常在末端，偶尔在中间形成，亚球型、单个，无色至白色、黄灰或白黄，外表光滑至粗糙，有时有小疣，大小（8μm~20μm）×（10μm~20μm）.F.racumniar在荧光或自然光培养 的PDA上，菌落蓝绿色，黑暗条件下为浅色，产孢快速且丰富.SNA和PDA上的分生孢子座都很丰富，但PDA上很少有菌丝链.气生的分生孢子梗在SNA上丰盛，通常无分枝或零星分枝，长230μm，宽2gm~2.5pm，形成单瓶梗粘在顶部，气生瓶梗钻型到近网柱型.气生分生孢子有两种类型，第一种是弯柱状到镰刀形，2～5隔膜，有足细胞，与镰刀形的分生孢子座的分生孢子形态区分明显，主要形成在较高的分生孢子梗上：第二种分生孢子微小、卵圆、0~1分隔，大小范围（4.5gm~13μm）×（2μm~ 3.5pm），平均（6.6μm~7.7μm）×（2.4μm~2.7p），在菌落的一小部分上形成，长在高50μm、宽2μm~3μm的短分生孢子梗上.
F.racumamiae分生孢子座的分生孢子梗轮状分枝或很少分枝，顶部生成单瓶梗，分生孢子座瓶梗形，背部和腹部线条接近平行，有尖锐的顶部细胞和明显的足细胞，（2~）3~4（~6）隔膜.SNA上3隔 简单、钻形、安铬瓶形，顶端通常有个显著的囊领.分生孢子座的分生孢子通常圆柱形、微弯，有时镰刀膜大型分生孢子大小范围为（38pm~72.5m）×（4μm~6.5μm），平均（52.2μm~63.3pm）×（4.7μm~4.9ym），在 PDA上，大小范围（34.5μm~71xm）×（4μm~5.5μm），平均（55.0μm~58.3μm）×（4.7μm~4.9μm），SNA上4隔膜大型分生孢子大小范围为（50.5μm~81gm）×（4 μm~~） ×（u²u）Vd(u²~ug） ×（u²9~9）*u g5.5pm）平均（58.0μm~61.4μm）×（4.7μm~5.0μm）.SNA上5隔膜大型分生孢子大小范围 （57.5μm~88.5 μm）×（3.5 μm~6 μm），平均(65.3μcm~74.1 μm）×（4.8 μm~5.1 pm）.第二种分生孢子座孢子或缺乏，短棍棒状、椭圆形或舟形，直或微弯，有一个圆的顶端和平截的基部，0～1分隔，[20μm~27μm（~51.5μm）]×（2.5pm~6 μm），在 PDA上偶尔形成链状，
1.4mm～1.6mm，黑暗条件下PDA上的菌落白色或黄白色，有时有蓝灰色色素，分生孢子的疣突浅黄 北美大豆猝死综合症病菌（F.virguliforme）在20C黑暗条件下PDA上的菌落每日生长速度为色；在荧光和日光条件下，PDA的菌落颜色从浅黄至灰黄、灰绿、浅绿、松石绿、深绿.气生菌丝在粘分生孢子团中稀疏分布在菌落上，有时丰富，为稀疏或密集的卷毛状，白色、黄白，有时灰绿色；菌落边缘完整或波状，背面色素缺乏，有时灰黄色、橘褐色，或橄榄褐色、黄福色，无味或有腐烂或霉味，SNA上的个不成链，透明或浅黄色，外表光滑或粗糙，（8μm~15μm）×（5.5μm~12μm），没有菌核，产孢快速而丰富.
F.virguliforme在PDA黑暗条件下菌落为浅色，在荧光和日光条件下有绿色到蓝色色素，分生孢
