中华人民共和国国家标准
GB/T31801-2015
丁香疫霉菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Phytophthora syringaeKleb.
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国天津出入境检验检疫局.本标准主要起草人：杜洪忠、罗加风、吴品珊、严进.
丁香疫霉菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了丁香疫霉菌的检疫鉴定方法.
本标准适用于针对丁香疫霉菌寄主的苗本、枝条、枝叶、果实及其夹带土壤和介质中丁香疫霉菌的鉴定，
2位器和用具
2.1仪器
生物显微镜，超净工作台，光照培养箱，电子天平（1/1000g），高压灭菌锅，冰箱，PCR扩增仪，荧光PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪，高速冷冻离心机，恒温水浴锅.
2.2用具
烧杯，三角瓶，量筒，试管，培养Ⅲ，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，接种针，载玻片，盖玻片，塑料研，移液器，移液器吸头，离心管，液氮罐.
3试剂、材料和培养基
3.1试剂
β-谷留醇，匹马霉素（pimaricin），氨苄青霉素钠盐（ampicillin），利福平钠盐（rifampicin），五氯硝基苯（pentachloronitrobenzene），恶霉灵（hymexazol)，CaCO ，琼脂糖，Tris-HCl MgCl，HCl，乙二胺四乙酸四钠盐（EDTA），NaOH，NaOAc，KCI，Tris，十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），TAE，无水乙醇（ethanol)，三氯甲烷（chloroform），异丙醇（isopropanol)，异戊醇（isoamyl alcohol)，SYBR Green I核酸染料，Man-MGB 探针 PS-Pr. 蛋白酶K，TaqDNA聚合酶，dNTP，通用引物ITS5和1TS4，实时荧光PCR引物PS-F和PS-R及Taq-
3.2材料
琼脂粉，V8汁，夏栎叶片或苹果或梨，鲜橙皮或杜鹃叶片.
3.3培养基
PDA培养基，V8培养基，V8鲜橙皮培养基，V8杜鹃叶片培养基，选择性培养基PARPH-V8.具体配方参见附录A.
4检疫鉴定方法
4.1症状检查
检查寄主植物的根、茎、叶、果实等部位，对有枯萎、果腐、根腐、颈腐和流胶症状的植物，以及根周围
GB/T 31801-2015
的土壤和介质取样送实验室做进一步检验.丁香疫霉菌为害症状参见附录A.
4.2寄主组织分离培养
可疑症状的根、茎、叶、果实用流水冲洗表面约15min，取根、茎、叶、果实果皮的病健交界处，剪成5mm×5mm小块，75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次，吸干水分，置选择性培养基PARPH-V8上，17℃黑暗培养.
培养4d~6d后，组织周围培养基上长出稀疏菌落，挑取菌落边缘菌丝块转人V8培养基或PDA培养基纯化，17C黑暗培养.
4.3土壤和介质诱集
称量土块或介质25g，碾碎放人500mL.灭菌洁净烧杯中.无菌水将土样或介质润湿（无流动水），保鲜膜覆盖封口.置于17℃~20C黑暗条件下放置3d~5d
（Quercas robur）叶片或未成熟的萃果或梨果实的小切片，切片大小以漂浮在水面为宜，Parafilm膜封口 每份样品加灭菌蒸馏水，水面距土表4.0cm然后加人10片左右直径8mm~10mm的新鲜夏栎保湿，17℃~20℃黑暗条件下放置.
4.4诱集检查和培养
诱集2d~3d后，观察夏标叶片或苹果或裂附近是否有棕色病变区，从变色的病健交界处取5mm×5mm小块，75%乙醇消毒30s，置V8培养基或选择性培养基PARPH-V8，17C黑暗培养.
培养4d～6d后，组织周围培养基上长出稀疏菌落，挑取菌落边缘菌丝块转人V8培养基纯化或PDA培养基，17C黑暗培养.
4.5孢子囊和菌丝膨大体诱发
取纯化后菌落边缘菌丝块，置于盛有10mL无菌水的培养Ⅲ中.17C～20C黑暗条件下诱发孢子囊和菌丝膨大体，48h后观察菌丝块周围孢子囊和菌丝膨大体产生情况.
4.6卵孢子诱发
取纯化后菌落边缘菌丝块，置于加人β-谷留醇（20mg/L）或植物油（玉米油、亚麻籽油、麦芽油）的V8培养基中，黑暗条件下8℃~10C低温培养4周.
如果寄主材料是柑橘属的果实，则将纯化后菌落边缘菌丝块置于V8鲜橙皮培养基或V8杜鹃叶片培养基，10C黑暗培养，7d后观测病菌卵孢子产生情况.
4.7DNA提取
收集分离到的病菌菌丝，采用CTAB法提取核酸.参见附录B.
4.8实时荧光PCR检测
实时荧光PCR引物序列为PS-F：5'-GTCTGGCTTCGGCTGGAT-3‘和PS-R：5'-AGTGGGC-TACTAGCTCCAGGC-3′.TaqMan-MGB 探针 PS-Pr: 5′-(FAM) TGGCGACCGCTCTGA (NFQMGB)-3，探针5'端标记的荧光报告基团为FAM.3'端标记的非荧光猝灭基团为MGB.
dNTPs 2 pl 10 μmol/L Primers 各 1 yL10 μmol/L 探针 PH-Pr 1.5 μL5 U/μL Tag DNA 聚合酶 反应体系（25pL）：样品DNA 1L，10×PCR缓冲液2.5pl，25mmol/LMgCl2μL，2.5mmol/L0.3 μL ddH; O 13.7 μL
反应循环为94℃10min；94℃15s，56℃60s.循环40次.
4.9ITS基因检测和序列比对分析
可以选择利用真菌通用引物PCR扩增后测序比对的分子方法.
利用真菌通用引物 ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)进行扩增.
反应体系(25pL);样品 DNA 1 pl 10× PCR 缓冲液 2.5 yL 25 mmol/L MgCl; 2 pL 2.5 mmol/LdNTPs 2 pL 10 pmol/L Primers 各 1 μzL5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.3 μL ddH;O 15.2 μL.同时设置空白对照，以Tris-EDTA缓冲液代答DNA 样品.
PCR反应条件为：94℃C 4min:95C 1 min，56℃30s 72℃C 45 s35个循环；72℃10min;4C保存.
PCR产物的检测，在1×TAE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖（含SYBRGreen1核酸染料）凝胶电泳，5V/cm，凝胶成像仪分析结果.如有900bp左右大小的条带出现，将扩增产物进行序列测定.
BLAST分析. 将测序后的序列与NCBI 网站 GenBank中公开发表的 Phytophikora syringae 的序列进行
5签定特征
5.1生物学特征
5.1.1菌落特征
状或菊花花瓣状，菌落的花瓣区域较尖、窄，菌落形态图参见附录C.在PDA上菌落边缘约呈花瓣状， 丁香疫霉菌在V8培养基和PDA培养基上生长较为缓慢.在V8培养基上菌落稀疏，呈放射状、星乳白色，菌丝体浓密菌落中央区域皱孔状.
5.1.2病菌形态
倒梨形，不易脱落，单独生在顶端或整个集结在一个孢子囊梗上.孢子囊大小为（21.0μm~75.0gm）× 无性生殖阶段孢子囊梗呈单歧聚伞花序状分枝.孢子囊具有不完全的乳头状突起，形状为卵形或（11.0μm~42.0μm），平均47.0μm×30.0μm，长宽比在1.1：1至2.111之间，孢子囊不易脱落，不增殖，但可直接在附近萌发产生一个新的孢子囊.孢子囊具有平的盖，裂开释放游动孢子，游动孢子卵形，侧生二根鞭毛.
内含物最终会逐渐释放殆尽，成为空壳. 病菌易产生菌丝膨大体，念珠状，卵形、球形或不规则形，常萌发产生较细的菌丝，菌丝膨大体中的
病菌为同宗配合，藏卵器球形，直径23.4μm~40.0μm：卵孢子充满藏卵器，通常为圆形，黄色，大小为20.1μm~34.7xcm；雄器单个或数个，平滑，多侧生.
丁香疫霉菌的形态图参见附录C.
5.1.3与近似种的形态区别
与丁香疫霉菌在形态上较为近似的是冬生疫霉菌（Phytophzhora hibernalis），主要区别为丁香疫霉菌落的花瓣区域较尖、窄，孢子囊不易脱落，具有菌丝膨大体，雄器多侧生；冬生疫霉菌落的花瓣区域较宽，孢子囊易脱落，无菌丝膨大体，维器多围生，参见附录D.
5.2实时荧光PCR检测
若阴性对照及空白对照的Ct值40，供试菌Ct值≤36，可判定为阳性.
