中华人民共和国国家标准
GB/T 32132-2015
动物性材料（羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒）属 性DNA鉴定方法实时荧光PCR法
DNA identification ofwool.cashmere.duck's down.goose's down animalmaterials-Real-time fluorescence PCRmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口. 本标准起草单位：深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、珠海出人境检验检疫局.本标准主要起草人：陈国培、赣心田、林霖、周李华、梁玉英、莫秋华、洪晓明、唐复润、胡科新、何永盛、杨友红、杨志敏、杨国武、杨泽.
动物性材料（羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒）属 性DNA鉴定方法实时荧光PCR法
1范围
本标准规定了羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒动物性材料中DNA成分实时荧光PCR定性检验方法.本标准适用于动物性材料中羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒等动物源性DNA成分的鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的一凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
本标准使用十二烷基磺酸钠-异硫氰酸脏-3-硫基乙醇法或其他等效DNA提取法，获得适用于实时荧光PCR反应，检测其中是否含有各种动物源性DNA成分，从而达到对动物性材料进行属性DNA成 荧光PCR检测的DNA，同时依据多种动物的物种特异性基因片段设计成特异性荧光引物，通过实时分定性检测的目的.
4仪器设备及器具
4.1实时荧光PCR仪.4.2超净工作台.4.3离心机（最高转数15000g）.0~04.5恒温水浴锅：（65土1）℃. 4.6超纯水系统（电阻率>18.2MΩcm）.4.7紫外分光光度计：230nm260nm 280nm.
5试剂和材料
5.12% SDS 溶液：称取2gSDS（sodium dodecyl sulfate，sodium salt，十二烷基磺酸钠）粉末，加人5 mL 1 mol/L Tris-HC1(pH8.o)[Tris： tris （hydroxymethy1) aminomethane，三(羟甲基)氨基甲烷]及4 mL0.5 mol/LEDTA（pH8.0）（ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸），加水定容至100mL，室温保存.
5.2异硫氰酸眠提取液：称取47.25g异硫氰酸胍、1.75g氯化钠、4gPVPK-40（PolyvinylpyrrolidoneK-40，聚乙烯略烷酮K-40），加人5mL1mol/LTris-HC1（pH8.0）及4mL0.5mol/LEDTA
（pH8.0），加水定容至100mL，室温保存.5.31mol/LTris-HC1（pH8.0）:800mL水中溶解121.1gTris碱，盐酸调pH值至8.0 加水至1000mL，高压灭菌，室湿保存.5.40.5mol/LEDTA（pH8.0）:800mL水中溶解186.1g乙二胺四乙酸二钠盐，NaOH调pH值至 8.0，补水至1000mL，高压灭菌，室温保存.5.53mol/L乙酸钠溶液：称取408.1g三水乙酸钠，加人800mL水溶解，用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容至1000mL，高压灭菌，4C保存.5.6酚：氯仿：异戊醇：25：24：1（体积比）. 5.7担体：非同一物种的植物或非脊椎动物基因组DNA，推荐使用糖原.5.8无水乙醇、异丙醇、3-疏基乙醇等有机试剂.5.9PremixExTag（2X），也可用等效的其他Taq酶或Tag 酶预混液.5.10引物和探针：动物性材料中羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒等动物源性DNA成分实时荧光PCR检测所用的荧光引物序列见表1.
表1实时荧光PCR检测所用荧光引物序列
检测基因 引物序列 探针序列脊椎动物 5′-AGATAGAAACCGACCTGGATT-3*内参照基因 5′-TTTACGACCTCGATGTTGGAT-3* 5′-FAM-TCCGGTCTGAACTCAGATCACGTA-BHQ-3′羊毛内源基因 5′-ACTTOCAATCAGTGAAATTGAC -3′ 5′-FAM- TGGAGCTTTAACTAAGTAACTCAAGGA -BHQ-3*羊绒内源基国 5′-TTCTOOGAGGTCACCCCAA-3′ 5′-FAM-TGGAGCTTTAACTAACTAGTCCAAAAG -BHQ-3′鸭绒内源基国 5′ACGTACATACCGCUCGTCA-3* 5 ′-FAM-ACATAATTAATACCACGTAAATGCCAA -BHQ-3? 5′-FAM-ACATAACTAATACCCTAAACATGCCAA -BHQ-3′绒内源基国 5′-ATTCTAAGTACACCTTCCGGT -3′ 5′-FAM-ATAACTAATACCATAAATACGCTGAA-BHQ-3?
6操作步骤
6.1模板DNA的提取
于样品不同部位取样，取0.05g~0.1g剪碎样品，加入3mL2% SDS溶液，65℃水浴1.5h，不时振荡；12000g离心5min，弃去上清液；加入3mL异硫氰酸胍提取液及60uLβ-蕴基乙醇，65C水浴4.5h，不时振荡；12000g离心5min，吸取上清液；加人等体积酚：氯仿：异戊醇（2524：1)，颠倒混匀；12 000g离心10min;吸取上清液，加人3μL20mg/mL糖原.1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）及等体积异丙醇，一20C沉淀过夜，12000g离心15min收集沉淀；小心倒去上清，用70%乙 醇洗涤二次，风干：加人50gL灭菌去离子水溶解沉淀.
6.1.2模板DNA提取的其他办法
可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA.
6.1.3样品DNA质量评估
取10gLDNA溶液加蒸馏水稀释至1mL，用紫外分光光度计分别测定260nm和280nm的吸光
值，DNA的浓度按照式（1）计算，当OD/OD比值在1.5~2.0之间时，符合PCR检测要求.扩增前将样品 DNA 调至约 10 ng/pL~100 ng/pl.
式中：
c--DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/uL）；
A260nm 处的吸光值；
N核酸稀释倍数.
6.2试样的PCR反应
6.2.1阳性对照和空白对照的设置
6.2.1.1阳性对照
以含所检源性成分的动物性材料及其加工产品的DNA为模板.
6.2.1.2阴性对照
以不含所检源性成分的动物性材料及其加工产品的DNA为模板.
6.2.1.3空白对照
设置两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品），二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）.
6.2.2实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表2，每个样品各做两个平行管.加样时应使样品DNA溶液完全落人反应液中，不要粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖.
表2实时荧光PCR反应体系
试剂名称 体积Premix Ex Taq(2×) 10 μl.10 μmol/L. 引物(上游) 0.4 pl.10μmol/1. 引物（下游） 0.4 yl.10 ytaol/1 探针 0.2 μL.DNA模板 10 ng~100 ng补水至 20 μl.注：表中DNA模板的加样量，可视所提取DNA的浓度适当增减模板量.
6.2.3实时荧光PCR反应参数
实时荧光PCR反应参数为：预变性95℃30s 95℃58.60℃34s 40个循环.注：不同仅器可根据仪器要求将反应参数作适当调整.
