中华人民共和国国家标准
GB/T33116-2016
Detection and identification of Acusta despecta (Gray.1839)
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化委员会（SAC/TC271）提出并归口
本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局、中国科学院动物研究所.
本标准主要起草人：周卫川、王沛、崔俊霞、吴志毅、肖琼、陈德牛.
琉球球壳蜗牛检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了琉球球壳蜗牛Arasta despecta（Gray，1839）的检疫鉴定方法.本标准适用于琉球球壳蜗牛的检疫鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
SN/T3067软体动物常规检疫规范
3术语和定义
SN/T3067界定的以及下列术语和定义适用于本文件.
蜗牛分泌的一种与壳口同样大小和形状的乳白色不透明黏液膜，用以封闭壳口.
3.2阴茎penis蜗牛雄性生殖器官.注：明茎系统一般由阴茎、開茎本体、用茎牵引肌和鞭状体组成.
矢囊dart sack
蜗牛雌性生殖系统中一个藏有1枚或多枚骨针的肌肉质的囊状结构.
3.4恋矢love dart注：恋矢的质地和形状常用于分类.
矢囊中钙质或壳质的骨针，为蜗牛交配时刺激器官.
3.5
受精囊bursa copulatrix
注：其中受精囊柄的形态和有无分支常用于分类鉴定. 蜗牛的受精器官，由受精囊和受精囊柄组成.
4基本信息
学名：Acasta despecta（Gray，1839）.其亚种有：A despecta despecta （Gray，1839）：A.despectapraetenuis (Pilsbry &. Hirase1904) =A.despecta sieboldiana (Pfeiffer 1850) 名 :Helix dexpectα Gray 1839 : A. despectα Sowerby 1839 ; Ealota sieboldiana Pfeiffer 1905 ;
GB/T 33116-2016
Ealota kikaiensis Pilsbry 1902;A. despecta ikiensis (Pilsbry &. Hirase 1904) ;A.despecta kikaiensis(Pilsbry 1902).
英文名：Ryukyu round snail:Korean round snail.
分类地位：琉球球壳蜗牛A.despecta（Gray，1839），在分类上属于软体动物门Mollusca，腹足纲Gastropoda，柄眼目 Stylommatophora，巴蜗牛科Bradybaenidae，球壳蜗牛属Acusta Albers，1860.琉球球壳蜗牛的近似种有灰球壳蜗牛A.ravida（Benson，1842）、红粉缘球壳蜗牛A.tourammensix（Sou-leyet 1842).
5方法原理
琉球球壳蜗牛昼伏夜出，常隐藏在人们难以发现的地方，易于传播.其传播特点是不需要特定的寄主，凡接触过地面的物品都可传播，传播方式和途径是确定现场检疫方式的依据.贝壳形态、软体解剖和分子特征是实验室鉴定的主要依据.
6器具和试剂
6.1器具
体视显微镜、放大镜、手电简、塑料自封袋、广口标本瓶、4mm孔径土壤筛、小铁铲、游标卡尺、白瓷盘、培养Ⅲ、镊子、剪刀、显微镊子、显微剪刀、微针、解剖蜡盘、标签、移液枪、微型离心机、PCR仪、1.5mL离心管、0.2mLPCR反应管、恒温金属浴.
6.2试剂
75%乙醇、无水乙醇、硫酸镁、动物基因组DNA提取试剂盒、PCR反应液、ddH：O.
7现场检测
对来自疫区（参见附录A）的运输工具和货物实施重点查验，仔细检查运输工具、废塑料、本质包装箱、苗木、水果、蔬菜、花卉、未经加工的植物性材料等是否有蜗牛附着其上，琉球球壳蜗牛昼伏夜出，尤其要注意阴暗蔽光处的检查，用手电筒仔细寻找蜗牛的行迹.琉球球壳蜗牛爬行过后，会留下银灰色的瓶，带回实验室做进一步的检验鉴定.发现盆景等携带土壤或其他细碎衬整材料时，需过筛检查是否有 丝带状黏液痕迹，这是判定是否有蜗牛污染的重要依据.发现蜗牛标本，随时装人塑料自封袋或标本卵或幼螺.
8实验室鉴定
8.1测量观察和软体解剖
螺的形态特征. 用游标卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽、卵粒直径.用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵和
将闷杀（见10.1）处理后的标本，参照SN/T3067解剖软体，分离出生殖系统.
8.2球蜗牛属AcusfaAlbers，1860鉴定特征
矢囊十分长，恋矢石灰质，无鞭状体. 贝壳圆球形，有脐孔，体螺层特大，膨胀，胚螺层常光滑，口缘呈椭圆形，口唇简单，锋利.阴道上的
8.3琉球球壳蜗牛A.despecta（Gray，1839）鉴定特征
8.3.1卵
卵粒圆形，白色.直径2.0mm左右.
8.3.2贝壳
8.3.2.1成螺
部低矮，呈矮圆锥形，体螺层增长迅速，下部特别膨大，呈弧形.壳顶钝，缝合线深.壳面为褐黄色或淡 贝壳中等大小，壳质薄，但坚固，呈圆球形.有5个～6个螺层前儿个螺层均匀增长，略凸出，螺旋褐色或赤褐色，具有细致而稠密的生长线和较粗的皱纹.壳口宽大圆形，口缘简单，不外折，锋利，内唇贴覆于体螺层上形成细薄的淡白色肼艇部，轴缘外折，略遮盖脐孔.脐孔狭小，呈孔穴状.壳高17.5 mm~21.0 mm.壳宽21.0mm~23.0mm.参见附录 B中图 B.1.
A.despecta sieboldiana（Pfeifer，1850）：镶边琉球球壳蜗牛A.despecta praelenxis （Pilsbry 本种有三个亚种：琉球球壳蜗牛指名亚种A.despecta despecta（Gray，1839）；锡伯琉球球壳蜗牛Hirase，1904），各亚种之间在形态上基本一致，略有微小差异.参见附录C中表C.1.
8.3.2.2幼螺
幼螺贝壳较小，壳质薄，透明，易碎，形态特征与成螺贝壳基本一致.
8.3.3螺体
动物软体多为淡灰色到茶色，螺体色泽变化较大，一般透过贝壳可以看到动物外套膜的形态.触角颜色明显比腹足为深，参见图B.2.
8.3.4生殖系统
输卵管短、粗大.阴道有部分插人到矢囊，远端稍呈球形到扁球形.副矢囊被压扁成弧状，中间有两枝黏液腺，分叉成葡萄状.输精管和阴蒸本体之间的界限不明显，阴茎牵引肌的基部稍变粗.阴茎 葡明显比阴茎牵引肌肥厚，粗细均匀，受精囊顶部稍肥厚，其后逐渐变细.受精囊呈小乳头状.参见图 B.3
8.3.5C01基因序列鉴定
列（Genbank登录号为AB852623.1）进行比对，相似度一般应≥92%.参见附录D. 按附录D方法提取DNA、PCR扩增和双向测序，将所测序列与已知琉球球壳蜗牛的COI基因序
9结果评定
见表C.2），符合8.3.2或同时符合8.3.2、8.3.3、8.3.4形态特征的蜗牛鉴定为疏球球壳蜗牛A.despecta 以贝壳形态为基本鉴定依据，螺体和生殖系统解剖形态为辅助鉴定特征，并注意与近似种鉴别（参（Gray，1939）.单独查获的卵粒符合8.3.1形态特征，应通过孵化和饲养实验（参见SN/T3067）.做进
