中华人民共和国国家标准
GB/T33119-2016
Detection and identification of Eutypa lata (Pers.）Tul.et C.Tul
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口，
本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、青岛检验检疫技术发展中心、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国安徽出人境检验检疫局、中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、中国科学院微生物研究所.
王振华、郭立新、蔡磊. 本标准主要起草人：王英超、段维军、厉艳、吴兴海、封立平、魏晓棠、甘琴华、纪瑛、邵秀玲、姚剑、
葡萄藤猝倒病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了葡萄藤猝倒病菌的检疫鉴定方法. 本标准适用于葡萄等寄主植物中葡萄藤猝倒病菌的检疫和鉴定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样SN/T2589植物病原真菌检测规范
3葡萄藤猝倒病菌基本信息
学名 :Eatypa latα (Pers.) Tul.et C.Tul.
异名 :Eatypa armeniacae Hansf. &. M. V Carter:Eutypa fraxini ( Nitschke) Sacc Eutypa mil-liaria (Fr.) Sace ; Eatypa lata var.aceris Rappaz Mycol. Helv: Cytosporina lata Hohn: Libertella ble pharis A.L.Sm.
分类地位：采用（真菌词典）第10版分类系统，葡萄藤猝倒病菌（Eutypalata）属真菌界（Fungi），子囊菌门（Asycota），盘菌亚门（Pezizomycotina），粪壳菌網（Sordariomycetes），炭角菌目（Xylariales），蕉孢壳科（Diatrypaceae），弯孢壳属（Eatypa Tul&.C.Tul.1863）.
茎、嫩枝、主干、枝条（菌丝），本材（孢子和菌丝）等. 传播途径：植物体在贸易和运输中能够传播该病害.植物体主要指树皮（孢子和菌丝），地上部分的
葡萄滕猝倒病菌的其他信息参见附录A.
4方法原理
葡萄滕猝倒病菌的为害症状、分离培养性状、形态特征和特异性PCR检测结果等是该检疫鉴定方法的主要依据.
5仪器设备和主要试剂
5.1仪器设备
生物显微镜、电子天平（感量0.001g）、离心机（12000g）、普通冰箱、超低温冰箱（一80℃）、涡旋振荡器、恒温光照培养箱、高压灭菌器、生物安全柜、PCR仪、电泳仪、凝胶分析成像系统、可调微量加样器、全自动DNA提取仪.
5.2主要试剂
0.5%次氯酸钠（NaCIO）、葡萄糖、琼脂、硫酸链霉素、盐酸金霉素、氯硝胺. 除另有规定外，试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定.
6现场检疫
部主要看有无溃疡症状：枝条是否长势短小，发育受阻，着生的叶子是否萎黄，卷缩变形或破碎；顶部是 按照SN/T2589，仔细检查寄主植物的茎、枝条、叶片等部位是否出现疑似症状（参见附录A），茎否出现枯萎症状.对可疑植物、繁殖材料应取样送实验室做进一步检验，取样方法和步骤参照SN/T 2122.
7实验室检疫
7.1PCR凝胶电泳初筛检测
将第6章中的可疑植物、繁殖材料等样品进行PCR初筛检测，PCR凝胶电泳检测见附录B.对于阳性结果进行下一步检测.
7.2病原菌的分离和培养
7.2.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基和选择性培养基的制备
马铃薯（去皮）200g；葡萄糖20g；琼脂15g；蒸馏水补至1000mL，121C湿热灭菌20min备用.分离培养时加硫酸链霉素（100μg/mL）、盐酸金霉素（50μg/mL）、氯硝胺（5μg/mL）作为选择性培养基.
7.2.2病原菌检查
检查寄主的树皮、枝条等组织有无子座、子囊壳，在显微镜下观察病菌的子囊壳，记录其形态特征，测量子囊和子囊孢子的大小.所获得分离物在马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行单孢分离纯化.
7.2.3组织中病原菌的分离和培养
如果发现可疑症状，但不能按7.2.2进行有性型形态检查，应采取下列分离培养的方法做进一步的鉴定.剥去树皮，纵向劈开树干露出内部遗疡的边缘.在无菌条件下，从溃疡部分的外部边缘切取1cm²的薄木片，放在0.5%次氯酸钠溶液中浸泡2min～5min.用无菌水重复洗3次，然后用无菌滤纸吸干，放在选择性培养基上进行培养.24C培养4d～7d后，将疑似菌落转到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行分离纯化.
8签定特征
8.1PCR凝胶电泳初筛检测
判定结果见附录B.
8.2培养性状
葡萄藤猝倒病菌在PDA培养基首先形成白色棉絮状菌丝，培养基背面奶油色.2周后，培养基上
出现灰色色素，培养基背面变成黑色.3周～4周后，在连续的光照培养下，形成小的黑色的分生孢子器.分生孢子丝状，直或弯曲数量多，大小（20pm~45μm）×（0.8μm~1.5μm）.见附录C.
8.3子囊壳的特征
子囊壳直径大约0.5mm，在枝干或茎上不规则分布.子囊壳的孔口裂出，具有不明显的沟槽，子囊从子囊壳顶点释放，子囊顶尖内陷，子囊大小（30μm~60gm）×（5pm~7.5μm），子囊柄长60gm~130μm，数量很多，纺锤状，内含有8个子囊孢子.子囊孢子香肠状，金棕色，亚透明，（6.5μm~11μm）×（1.8μm~2m）.在培养基上不能生成子囊壳（见附录C).
9结果判定
以PCR初筛结果、分离物的培养性状、子囊壳的特征等作为鉴定依据，进行综合判定.若PCR初筛结果为阳性，并发现子囊壳，且与8.3鉴定特征吻合，鉴定为葡萄藤猝倒病菌：若PCR初筛结果为阳 性，未发现子囊壳，但与8.2鉴定特征吻合，鉴定为葡萄藤猝倒病菌.
10样品保存
10.1样品保存与处理
复核.该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理. 样品经登记和经手人签字后妥善保存.对检出葡萄藤猝倒病菌的样品应保存于4C冰箱中，以备
10.2菌株保存与处理
脂培养基斜面上，24C培养72h，然后4C冰箱保存.对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理. 从检测样品中分离并鉴定为葡萄藤猝倒病菌的菌株，应妥善保存.将菌株接种于马铃薯葡萄糖琼
10.3结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字，PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片.
