中华人民共和国国家标准
GB/T 35337-2017
Detection andidentification of Grapevine yellow speckle viroid
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
学院植物保护研究所. 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中国农业科
本标准主要起草人：张永江、邓丛良、骆卫峰、赵晓丽、吕玉峰、张志想、辛言言.
葡萄黄点类病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了葡萄黄点类病毒的检疫鉴定方法.本标准适用于可能带有葡萄黄点类病毒的葡萄繁殖材料的检疫鉴定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3葡萄黄点类病毒基本信息
学名：Grapevine yellone speckle viroid .缩写：GYSVd.异名：葡萄黄斑类病毒、葡萄黄痘类病毒.分类地位：马铃薯纺锤块茎类病毒科（Paspiviroidae）、苹果锈果类病毒属（Apscairoid）.
葡萄黄点类病毒的其他信息参见附录A.
4方法原理
类病毒检测主要针对其核酸序列.主要的方法有RT-PCR和核酸分子杂交.
5仪器设备、主要用具和主要试剂
5.1仪器设备
电子天平（感量0.001g）、普通天平（感量0.1g）、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱（一80C）、制冰机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、PCR仪、微波炉、电泳仪、电 泳槽、凝胶分析成像系统、实时荧光PCR仪、杂交炉、塑料薄膜封口机、紫外交联仪、暗箱、摇床、恒温水浴锅、组织破碎仪等.
5.2主要用具
可调移液器(2.5μL、10μL、20μL、200μL、1000μL、5000μL)、无RNA酶吸头（10pL、20μL反应管（200L）、实时荧光96孔反应板、杂交瓶、杂交膜、杂交袋、X光片.
5.3主要试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定.普通RT-PCR检
GB/T 35337-2017
测试剂见附录B：实时荧光RT-PCR检测试剂见附录C；斑点杂交检测试剂见附录D.
6检测与鉴定
6.1普通RT-PCR检测方法
普通RT-PCR检测方法见附录B.
6.2实时荧光RT-PCR检测方法
实时荧光RT-PCR检测方法见附录C.
6.3斑点杂交检测方法
斑点杂交检测方法见附录D.
7结果判定
定为检出葡萄黄点类病毒. 样品经普通RT-PCR检测为阳性，且实时荧光RT-PCR检测为阳性或斑点杂交检测为阳性，则判
样品经普通RT-PCR检测为阳性，且序列测定结果与已知的GYSVd序列一致，则判定为检出葡萄黄点类病毒.
样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性，且序列测定结果与已知的GYSVd序列一致，则判定为检出葡萄黄点类病毒.
8样品保存与结果记录
8.1样品保存
离温室中培养，叶片、果实等样品在一80C冰箱内保存.对检出葡萄黄点类病毒的样品应至少保存 样品经登记人和经手人签字后妥善保存3个月，种子保存在4C冰箱内，生长苗木或插条保存在隔6个月，以备复核、谈判和仲裁.保存期满后，应灭活处理.
8.2结果记录
员的签字：普通RT-PCR检测结果保存电泳照片：实时荧光RT-PCR检测结果保存荧光曲线图及Ct 完整的实验记录要包括样品的来源、种类、采集时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人值；斑点杂交检测保存照片.
附录A
葡萄黄点类病毒相关资料 （资料性附录）
A.1基本信息
病毒，于1972年在澳大利亚首次发现，包括葡萄黄斑类病毒1号（Grapevineyelfow speckleviroid 1， 葡萄黄点类病毒（Grapevine yellorc speckleviroid，GYSVd），又名葡萄黄斑类病毒和葡萄黄痘类GYSVd-1)和葡萄黄斑类病毒2号（Grapevine yellow speckle uiroid 2 GYSVd-2).
A.2寄主范围
自然条件下侵染葡萄（Vitisinifera）.
A.3危害症状
出现黄色环斑或斑驳.病班多分布于主脉或侧脉附近.与葡萄扇叶病毒复合侵染，产生镶脉症状. 寄主受GYSVd侵染后，多表现隐症.有的葡萄叶片产生黄色斑点或形状不规则的黄色斑块，有时
A.4分布地区
澳大利亚、美国、法国、意大利、西班牙、日本、中国等国家.
A.5传播方式
GYSVd主要通过嫁接传播和机械传播，也可通过种子传播.
A.6基因组
GYSVd为单链环状的RNA分子，长363个～367个核苷酸，能形成类病毒典型的杆状二级结构.GYSVd与苹果锈果类病毒（Apple scar skinruiraid，ASSVd）有37%的序列相似性，与马铃暮纺锤块茎类病毒科的其他类病毒也有一定的序列相似性.GYSVd缺乏该科大多数类病毒具有的中央保守区， 但与ASSVd中央保守区序列一致，且都含有稳定的回文结构.
