中华人民共和国国家标准
GB/T 36752-2018
Detectionandidentification ofSowbanemosaicvirus
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、浙江大学.
本标准主要起草人：张永江、冯黎霞、向均、廖富荣、吴建祥、辛言言、李桂芬、陈青.
藜草花叶病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准适用于可能带有藜草花叶病毒的植物种子、苗木及植物产品的检疫鉴定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3蔡草花叶病毒基本信息
学名：Soubane mosaicvirus缩写：SoMV分类地位：南方菜豆花叶病毒属（Sobemovirus）成员
藜草花叶病毒的其他信息参见附录A.
4方法原理
特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）：依据SoMV的基因组特征 藜草花叶病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据.根据SoMV与抗体之间的建立RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法：通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有SoMV.
5仪器用具与试剂
5.1仪器
电子天平（感量0.001g）.高速冷冻离心机（最大转速15000r/min）.小型瞬时离心机（最大转速7000r/min）.普通冰箱（4℃）.超低温冰箱（-80C）. 制冰机（每日制冰能力为110kg）.旋涡振荡器（最大转速为2800r/min）.磁力搅拌器（搅拌容量50mL~2000mL）.pH计（量程pH0.00~14.00，精度±0.01pH）. 高压灭菌锅（最大压力为0.235MPa，可调控温度范围为105C~135C）.
PCR仪（温度范围4C~99C，控湿精度土0.25℃）.
实时荧光PCR仪（湿度范围4C~99℃，控温精度土0.25C）.
微波炉（烧烤型）.
电泳仪（输出电压5V~600V，输出电流2mA~200mA）
凝胶成像分析仪（光强连续可调302nm紫外透照仪、顶置白光光源、白光转换板、UV干涉滤光片、机载头像捕提软件、图像分析软件）.
洗板机（清洗容量50μL~2000μL).
酶标仪（光源波长：250nm~750nm，温度范围4C~99C）.
5.2用具
酶联板.可调移液器（2.5μL，10pL，20μL.100μL、200μL，1000μL）.1.5 mL离心管. 可调移液器头.
研体、微型磨等.
5.3试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定. DAS-ELISA试剂见附录 B.RT-PCR检测试剂见附录C.实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D
6检测样品的制备
6.1种子样品
挑取畸形种子播于灭菌土中，待长出3片～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分
组（10株为1组）并编号，采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联测定和分子生物学检测.
也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测.
6.2苗木及植物产品
有症状的部分（如叶片畸形、花叶、斑驳等）单独编号检测.没有症状或无法观察症状的植物产品，
按照SN/T2122中规定的抽样方法进行抽样，分组编号、分组方法和检测方法同6.1.
7检测鉴定
7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）
把制备的样品上清液加入已包被SoMV抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA检测，每个样品平行加到两个孔中.健康的植物组织作为阴性对照感染SoMV的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲液作为空白对照；其中阴性对照的植物种类和材料（如叶片）应尽量与检测样品相一致.
具体操作见附录 B.
7.2RT-PCR检测
RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照.分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见附录C.如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行.
7.3实时荧光RT-PCR检测
实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照.分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录D，如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行.
7.4斑点酶联免疫吸附测定（Dot-ELISA）
把制备的样品上清液点在硝酸纤维素膜上，进行Dot-ELISA检测，对照设置同7.1.具体操作见附录E.
8结果判定
DAS-ELISA、Dot-ELISART-PCR和实时荧光RT-PCR中两种检测方法的结果为阳性即可判定样品携带SoMV.
9样品保存与结果记录
9.1样品保存
经检测确定携带SoMV的样品应保存在适合的条件下以备复核.如种子保存在4C，种苗、叶片等样品保存在一80C冰箱中；做好登记和标记工作，保存期限至少1年.
9.2结果记录
记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字.DAS-ELISA检测应有酵联反应数值：Dot-ELISA检测应有检测图谱：RT-PCR检测应有电泳图片：实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图，
