中华人民共和国国家标准
GB/T 35939-2018
Indirect enzyme linked immunosorbent assay for detecting theantibody against encephalomyocarditisvirus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由中华人民共和国农业部提出.本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口. 本标准起草单位：南京农业大学、中国动物卫生与流行病学中心.本标准起草人：白娟、王岩、姜平、蒋康富.
脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法
1范围
本标准规定了脑心肌炎病毒间接ELISA抗体的检测方法.注：脑心肌炎疫病简介参见附录A. 本标准适用于猪脑心肌炎病毒抗体的检测、猪脑心肌炎血清流行病学调查和实验室诊断.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范SN/T2984检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则
3缩略语
BSA:牛血清白蛋白(Bovine serum albumin) 下列缩略语适用于本文件.ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay）EMCV：脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditisvirus)HRP-SPA：辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白（Horseradish peroxidase labeled staphylococcalprotein A) TMB：四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine)
VP1:病毒结构蛋白 1(Viral protein 1)
4仪器、材料与试剂
4.1试验仪器
4.1.1酶联免疫检测仪.4.1.2高速台式冷冻离心机.4.1.3微量移液器：000[000000°04.1.412道可调微量移液器： 规格10μxL~100μL
4.2试验材料
4.2.2注射器（5mL). 4.2.196孔酶标反应板.
GB/T 35939-2018
4.2.3微量离心管（1.5mL).4.2.4吸头（可与移液器配套）.
4.3主要试剂
4.3.1重组EMCVVP1抗原（制备方法见附录B中的B.1）. 4.3.2EMCV阳性血清和EMCV阴性血清（制备方法见附录B.2）.4.3.3 HRP-SPA.4.3.4TMB（见附录C）.4.3.5商品化EMCV抗体检测试剂盒.
5EMCV间接ELISA抗体检测方法
5.1样品采集、运输与保存处理
5.1.1样品要求
按NY/T541采集猪血液按SN/T2984处理待检猪.另外按GB19489进行检测.
5.1.2样品采集与运送
下送到实验室. 采用消毒注射器经猪颈静脉采集血液2mL，若无血清分离条件，待血液凝固后24h内在冷藏条件
5.1.3血清分离、保存与运送
取5.1.2凝固血液，2000r/min离心5min，收集上清放人无菌微量离心管中，用于抗体检测，或置一20C保存，并在冻结状态下送往实验室：要求血清清亮，无溶血.
5.2ELISA操作步骤
5.2.1EMCVVP1蛋白包被板的制备：
a）抗原包被：用pH9.6抗原包被液（见C.1）将纯化的重组EMCVVP1蛋白稀释成2.0μg/mL， 加人96孔酶标反应板，每孔100gL，置37℃2h；b）洗涤：弃去孔中液体，加洗涤液洗涤（PBST，见C.5），每孔300μL，洗涤3次，每次3min，洗涤后甩去孔中液体，最后一次甩掉后，在吸水材料上用力扣磕反应板，但应避免孔壁变干：c）封闭：加入含5%脱脂乳粉的PBST，200pL/孔，置37C下封闭2h；e）加保护剂溶液：加人抗原保护剂（见C.3），100pL/孔，置37C下作用1h； d）洗涤：同5.2.1b）；f）密封：置37C干燥，用锡箔纸真空包装，密封.
5.2.2加被检血清及对照血清：每份被检血清各取4μL分别加到有196μL稀释液的微量离心管中，作1：50倍稀释.混匀后分别取100μL依次加人间接ELISA板反应孔中，每份血清加两个孔，每块反应板设阴性血清和阳性血清（1：50倍稀释）对照各两孔，每孔100gL.盖好包被板置37C湿盒内孵 育1h.
待检血清样品数量较多时（≥10份），应先使用血清稀释板稀释待检血清，再将稀释好的血清转移到抗原包被板，尽可能使反应时间一致.
5.2.3洗涤同5.2.1b）
5.2.4加酶标记抗体和孵育：加人PBST稀释工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗体（HRP-SPA）
（113000稀释） 100μL/孔，37℃孵育0.5h.5.2.5洗涤同5.2.1b）.5.2.6加底物缓冲液和孵育：每孔加新配制的底物溶液（见C.6)100pL，37C避光孵育5min~15min（参见附录D）.5.2.7终止反应见阳性对照血清孔呈鲜明的蓝色，阴性对照血清孔无色或基本无色，加人2mol/1 HSO;溶液（见C.7），50pL/孔，终止反应.5.2.8酶标反应板在波长为450nm的酶联免疫吸附仪下读取各孔的OD值，15min内完成.
5.3结果判定
5.3.1结果计算
P/N计算，P/N=被检血清的两孔平均OD值/朗性对照血清的两孔平均OD值.
5.3.2判定
阳性对照血清平均OD值≥0.5，阴性血清两孔平均OD值≤0.2，判定试验条件成立.当P/N≥2.1，判为阳性，P/N<2.1则判为阴性.或使用商品化EMCV抗体检测试剂盒，其操作和判定按其说明书进行.
