中华人民共和国国家标准
GB/T 36846-2018
Detection andidentification ofPotatovirus M
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国中山出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、浙江大学.
本标准主要起草人：刘忠梅、刘洪义、马微、陈定虎、栾风侠、张永江、封立平、李明福、吴建祥、李桂芬、魏梅生、杨立群.
马铃薯M病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了马铃薯M病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法.本标准适用于可能带有马铃薯M病毒的马铃薯植株、繁殖材料及其他寄主植物的检疫鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB7331马铃薯种薯产地检疫规程
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法
3马铃薯M病毒基本信息
缩写：PVM
异名:Kartoffel-Rollmosaik virus Ksrtoffel-K-virus Potato interveinal mosaic virus Potato leafrolling mosaic virus Potato M carlavirus* potato paracrinkle virus. Potato virus E Solanum virus11 Solanum virus 7
分类地位：乙型线状病毒科（Beraflexiviridae），香石竹潜隐病毒属（Carlavirus）.
传播途径：该病毒可通过机械接种传播和蚜虫的非持久性传播，也可通过种薯、商品薯、组培苗等繁殖材料远距离传插.
马铃薯M病毒的其他信息参见附录A.
4方法原理
附测定（ELISA）方法和斑点酶联免疫吸附测定（dot-ELISA）方法：依据PVM的基因组特征建立反转录 PVM的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据.依据PVM免疫原性建立酶联免疫吸
5仪器设备、用具及试剂
5.1仪器设备
系统、制冰机、超净工作台、高压灭菌锅、低湿冰箱、电子天平（0.001g）、涡旋振荡器、恒温培养箱等. 酶标仪、PCR仪、电泳仪、生物安全柜、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、pH计、凝胶成像
5.2用其
可调移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、1 000gL）吸头、离心管和研体等.
5.3试剂
除有特殊说明外，实验用试剂均为分析纯或生化试剂.
双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）所需试剂见附录B，RT-PCR检测所需试剂见附录C，RT-LAMP检测所需试剂见附录D dot-ELISA检测所需试剂见附录E.
6抽样与样品制备
6.1抽样
马铃薯贸易商品、科研用薯材料、国际间种质交流材料及其他寄主植物等现场抽样按照SN/T2122的规定执行，田间调查采样按照GB7331的规定执行.
6.2马铃薯组培苗、微型薯、块茎等样品的制备
将马铃薯组培苗、微型薯、块茎播于非土介质或灭菌土中，于25C左右生长并进行症状观察.待长出3片～4片真叶后将表现症状的植株单独编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号.表现可疑症状的累殖材料，可直接用于检测必要时再进行栽培生长实验.
6.3茄科等寄主植物种子样品的制备
将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，于25C左右生长并进行症状观察.待长出3片～4片真叶后将表现症状的植株单独编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号.
7检疫鉴定方法
7.1DAS-ELISA 检测
见附录B.如果使用试剂盒，应按照说明书进行操作.
7.2RT-PCR检测
见附录C.
7.3RT-LAMP检测
见附录D.
见附录E.
8结果判定
样品检测时，可采用DAS-ELISA、dot-ELISA或RT-LAMP检测进行初步筛检.检测流程及结果判定按下述原则进行：
经过血清学检测（7.1、7.4任选其一），若检测结果为阳性，采用RT-PCR方法（7.2）进行验证，验证结果为阳性，则判定样品检出PVM；
2 经过分子检测（7.3），若检测结果为阳性，采用血清学检测（7.1、7.4任选一种）进行验证，验证
结果为阳性，则判定样品检出PVM；经过血清学检测（7.1、7.4任选其一）或分子检测（7.3），若检测结果为阴性，则判定样品未检出PVM.
9样品保存与结果记录
9.1样品保存
结果判定为阳性的样品应妥善保存，种子样品可保存在室温干燥环境中：叶片样品保存在一20℃或一80C冰箱中，并作好标记和登记工作，以备复验、谈判和仲裁.保存期限至少1年，保存期满后，应经灭活处理.
9.2结果记录
完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、采集时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人员的签字：酶联免疫吸附方法应有酶联反应的原始数据，dot-ELISA检测应附显色图片，RT-1LAMP检测应附结果图片，RT-PCR检测应有电泳结果图片和测序结果.
