中华人民共和国国家标准
GB/T36858-2018
饲料中黄曲霉毒素B的测定 高效液相色谱法
DeterminationofaflatoxinB infeeds-High performance liquid chromatography
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由全国何料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口.本标准起草单位：华中农业大学.本标准主要起草人：齐德生、张妮娅、张家才、孙铝辉、王峻、陶灿、王帅.
饲料中黄曲霉毒素B的测定 高效液相色谱法
警示一黄曲霉毒素B：是高致癌物质，应小心处理，分析操作过程应在通风橱内或指定区域内进行，分析过程中，操作者应采取相应的防护措施.分析过程结束后，接触过的器血及黄曲霉毒素B溶液应使用浓度为5%的次氯酸钠溶液浸泡过夜.
1范围
本标准规定了测定何料中黄曲霉毒素B的高效液相色谱法. 本标准适用于何料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料中黄曲霉毒素B的测定.本方法的检出限为0.5μg/kg，定量限为2.0pg/kg.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备
3原理
试样中的黄曲霉毒素B：经黄曲霉毒素B提取溶液提取后，再经三氯甲烷萃取、三氟乙酸衍生衍生后的黄曲霉毒素B采用反相高效液相色谱-荧光检测器进行测定，外标法定量.
4试剂或材料
除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂.
4.1水：符合GB/T6682中规定的一级用水4.2甲醇：色谱级.4.3乙晴：色谱级.4.4三氯甲烷.4.6黄曲霉毒素B衍生溶液：分别量取20mL三氟乙酸，加人70mL水中，混匀后加人10mL冰乙 4.5黄曲霉毒素B提取溶液：量取84mL乙睛加入到16mL水中，混匀.酸，混匀.临用现配.4.7流动相：分别量取20mL甲醇、10ml乙睛和70mL水，混匀.经0.22pm有机滤膜过滤后备用.4.8黄曲霉毒素B标准储备溶液（1000pg/mL)：精确称取黄曲霉毒素B对照品（纯度≥98%）10.0mg用10ml.乙晴完全溶解，配制成黄曲霉毒素B含量为1000pg/mL的标准储备溶液，-20C保存，有效期为6个月.或有证标准溶液.
GB/T 36858-2018
4.9黄曲霉毒素B标准工作溶液：取1.0mL黄曲霉毒素B标准储备溶液，用乙晴定容至100mL，浓度为10μg/mL.再取此稀释液1.0mL 用乙晴定容至100mL，则浓度稀释为100ng/mL的标准工作溶液，4.10黄曲霉毒素B标准系列溶液：将黄曲霉毒素B标准工作溶液用乙晴分别稀释成1ng/mL、2 ng/mL、5ng/mL、10ng/mL 20ng/mL50ng/mL、100ng/mL 的标准系列溶液.临用现配. 4.11有机滤膜：直径50mm，孔径0.22pm4.12针头式过滤器：有机型，孔径0.22pm.4.13乙腾水溶液（9010）：量取90mL乙睛，加人到10mL水中，混匀.
5仪器设备
5.1高效液相色谱仪：配备荧光检测器.5.2分析天平=感量为0.01mg.5.3溶剂过滤器：规格1000ml.5.4氮吹仪. 5.5恒温振荡器.5.6旋涡混合仪.5.7超声波清洗仪.5.8水浴锅.
6样品
按GB/T14699.1规定采集有代表性的试样，按照GB/T20195规定将试样粉碎，过0.42mm分析筛，混匀后装人密闭容器中，备用.
7试验步骤
7.1试样处理
平行做两份试验.称取5.00g（精确到0.01g）试样置于100mL带塞锥形瓶中，加人25.0mL黄曲霉毒素B提取溶液（4.5），室温下200r/min振荡提取60min，用中速滤纸过滤，取10.0mL滤液于50mL具塞离心管中，加人10.0mL三氯甲烷（4.4）萃取，旋涡混合1min，静置分层后，取下层萃取液 于15mL具塞离心管中，50℃水浴氮气吹干.加人200pL乙水溶液（4.13）复溶，然后加人700pL黄曲霉毒素B衔生溶液（4.6），加塞混匀，40C下恒温水溶衍生反应75min后，经0.22pm微孔滤膜过滤后，待测
7.2标准系列
分别取0.9mL黄曲霉毒素B标准系列溶液（4.10）于7个10mL具塞离心管中，50℃水浴氮气欧干，用200pl乙晴水溶液（4.13）复溶，然后加700μL黄曲霉毒素B衍生溶液（4.6），加塞混匀，40C下恒温水浴衍生反应75min，再经0.22um微孔滤膜过滤后，待测.
7.3高效液相色谱参考条件
色谱柱：C色谱柱，长250mm，内径4.6mm，粒径5pm：或性能相当者.
流动相（4.7）流速：1mL/min.激发波长：365nm：发射波长：440nm.柱温：30℃进样体积：20yL.
7.4测定
在上述液相色谱参考条件下，将衍生后的黄曲霉毒素B：标准系列溶液、试样溶液注人高效液相色谱仪，测定相应的响应值（峰面积），采用单点或多点校正，外标法定量.黄曲霉毒素B标准溶液色谱图参见附录A.
8试验数据处理
试样中黄曲霉毒素B的含量以质量分数u表示，单位为微克每千克（pg/kg），按式（1）计算：
式中：
试样衍生液在标准曲线上对应的黄曲霉毒素B含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V提取液的总体积，单位为毫升（mL）； V：用于萃取的提取液体积，单位为毫升（mL）；m-试样的质量，单位为克（g)；0.9-衍生后的试样溶液体积，单位为毫升（mL）.
9精密度
在重复性条件下，两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值，不大于该平均值的20%.
