中华人民共和国国家标准
GB 5009.111-2016
食品安全国家标准
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局 发布
前言
本标准代替GB/T5009.111-2003《谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定》、GB/T23503-2009《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》、SN/T1571-2005 《进出口粮谷中呕吐毒素检验方法液相色谱法》.
本标准与GB/T5009.111-2003相比，主要变化如下：
标准名称修改为“食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测增加了方法的适用范围： 定”：增加了食品中脱氧雪腐刀菌烯醇乙酰化衍生物的测定；增加了同位素稀释液相色谱-申联质谱法：一增加了固相萃取柱净化的前处理方式；增加了商业化免疫亲和柱评价技术参数要求. 增加了免疫亲和柱净化-高效液相色谱法；
食品安全国家标准
食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇 及其乙酰化衍生物的测定
1范围
本标准规定了食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定方法.
第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法，适用于谷物及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中脱
第二法为免疫亲和层析净化高效液相色谱法适用于谷物及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定.
第三法为薄层色谱测定法，第四法为酶联免疫吸附筛查法，适用于谷物及其制品中脱氧雪腐刀菌烯醇的测定.
第一法同位素稀释液相色谱-串联质谱法
2原理
试样中的脱氧雪腐刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇用水和乙的混合溶液提取，提取上清液经固相萃取柱或免疫亲和柱净化，浓缩、定容和过滤后，超高压液相色谱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量.
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
3.1试剂
3.1.1乙晴（CHCN)：色谱纯.3.1.2甲醇（CHOH）：色谱纯.3.1.3正已烷（C H). 3.1.4 氨水（NHHO）.3.1.5甲酸（HCOOH）.3.1.6氮气（N）：纯度≥99.9%.
3.2试剂配制
3.2.1乙晴-水溶液（8416）：量取160mL水加人到840mL乙晴中，混匀.3.2.2乙精饱和的正己烷溶液：量取200mL正已烷于250mL分液漏斗中.加人少量乙晴，剧烈振摇数分钟，静置分层，弃去下层乙晴层即得.
GB 5009.111-2016
3.2.3甲醇-水溶液（595）：量取5mL甲醇加人到95mL水中，混匀3.2.40.01%氨水溶液：取100L氨水加人到1000mL水中，混匀（仅供离子源模式为ESI-时使用）.3.2.50.1%甲酸溶液：取1mL甲酸加人到1000mL水中，混匀（仅供离子源模式为ESI时使用）.
3.3标准品
3.3.1脱氧雪腐刀菌烯醇（DON，CHO，CAS号：51481-10-8）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质.3.3.23-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-ADON，CHO，CAS号：50722-38-8）：纯度≥99%，或经国家 认证并授予标准物质证书的标准物质.3.3.315-乙酰脱氧雪腐刀菌烯醇（15-ADON，CHO，CAS号：88337-96-6）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质.3.3.41C-脱氧雪腐镰刀菌烯醇同位素标准溶液（C-DON，C；HO）：25μg/mL，纯度≥99%.≥99 %.
3.4标准溶液配制
3.4.1标准储备溶液（100 μg/mL):分别称取 DON、3-ADON和15-ADON 1 mg（准确至 0.01 mg），分 别用乙晴溶解并定容至10mL.将溶液转移至试剂瓶中，在一20℃下密封保存，有效期1年.3.4.2混合标准工作溶液(10μg/mL)：准确吸取 100 μg/mL DON、3-ADON和15-ADON 标准储备液各1.0mL于同一10mL容量瓶中，加乙晴定容至刻度.在一20C下密封保存，有效期半年.3.4.3混合同位素内标工作液（1μg/mL）：准确吸取”Cs-DON和C-3-ADON同位素内标（25μg/mL）各1mL于同一25mL容量瓶中，加乙腾定容至刻度.在一20℃下密封保存，有效期 半年，配制成 10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL 80 ng/mL 、160 ng/mL、320 ng/mL 640 ng/mL 的混合标准系列，其中同位素内标浓度为100ng/mL.标准系列溶液于4C保存，有效期7d.
4仪器和设备
4.1液相色谱-申联质谱仅：带电喷雾离子源.4.2电子天平：感量0.01g和0.000 01g. 4.3高速粉碎机：转速10000r/min.4.4匀浆机.4.5筛网：0.5mm~1mm孔径.4.6超声波/涡旋振荡器或摇床.4.8高速离心机：转速不低于12000r/min. 4.7氮吹仪.4.9移液器：量程10pL~100yμL 和100pL~1 000μL4.10固相萃取装置.4.11通用型固相萃取柱：兼具亲水基团（吡咯烷酮基团）和疏水基团（二乙烯基苯）吸附剂填料的固相萃取小柱，200mg，6mL，或相当者. 4.12DONs专用型固相净化柱，或相当者.4.13脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱：柱容量≥1000ng（柱容量和柱回收率验证方法参见A.2）.2
4.14水相微孔滤膜：0.22μm.
5分析步骤
5.1试样制备
5.1.1谷物及其制品：取至少1kg样品用高速粉碎机将其粉碎，过筛使其粒径小于0.5mm~1mm孔径试验筛，混合均匀后缩分至100g，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用.
5.1.2酒类：取散装酒至少1L，对于袋装、瓶装等包装样品至少取3个包装（同一批次或号），将液氧化碳的酒类样品使用前应先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气后方可使用. 体试样在一个容器中用均质机混匀后，缩分至100g（mL）储存于样品瓶中，密封保存，供检测用.含二
号），将液体样品在一个容器中用匀浆机混匀后，缩分至100g（mL）储存于样品瓶中，密封保存，供检测用.
5.2试样提取
5.2.1谷物及其制品：称取2g（准确至0.01g）试样于50mL离心管中，加人400gL混合同位素内标工作液振荡混合后静置30min.加人20.0mL乙腾-水溶液（8416)，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20min.10000r/min离心5min，收集上清液A于干净的容器中备用.
5.2.2酒类：称取5g（准确至0.01g）试样于50mL离心管中，加人200gL混合同位素内标工作液振 荡混合后静置30min，用乙晴定容至10mL.混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡20min，10 000r/min离心5min，收集上清液B于干净的容器中备用.
5.2.3酱油、醋、酱及酱制品：称取2g（准确至0.01g）试样于50mL离心管中，加人400gL混合同位素内标工作液振荡混合后静置30min.加人20.0mL乙晴-水溶液（8416）.置于超声波/涡旋振荡器 或摇床中超声或振荡20min.10000r/min离心5min，收集上清液C于干净的容器中备用.
5.3试样净化
注：下述试样的净化方法，可根据实际情况，选择其中一种方法即可.
5.3.1通用型固相萃取柱净化
取5mL上清液A或上清液B或上清液C置于50mL离心管中，加人10mL乙晴饱和正已烷溶液，涡旋混合2min，5000r/min离心2min，弃去正已烷层后，于40℃～50C下氮气吹干，加人4mL水充分溶解残渣，待净化.
将固相萃取柱连接到固相萃取装置，先后用3mL甲醇和3mL水活化平衡.将4mL上述水复溶液上柱，控制流速为每秒1滴～2滴.用3mL水、1mL5%甲醇-水溶液依次淋洗柱子后彻底抽干.用4mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液后在40℃～50℃下氮气吹干，加人1.0mL初始流动相溶解残留物，涡旋混匀10s，用0.22μm微孔滤膜过滤于进样瓶中，待进样.
5.3.2DONs专用型固相净化柱净化
取8mL上清液A或上清液B或上清液C至DONs专用型固相净化柱的玻璃管内，将净化柱的填料管插人玻璃管中并缓慢推动填料管至净化液析出，移取5mL净化液于40℃～50℃下氮气吹干.加人1.0mL初始流动相溶解残留物，涡旋混匀10s，用0.22μm微孔滤膜过滤于进样瓶中，待进样.
注：使用不同厂商的DONs专用型固相净化柱，在上样、净化等操作方面可能略有不同，可按照说明书要求进行操作.
