中华人民共和国国家标准
GB 5009.303-2025
食品安全国家标准
食品中酵母β-葡聚糖的测定
中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局 发布
食品安全国家标准
食品中酵母β-葡聚糖的测定
1范围
本标准规定了食品中不溶性酵母3-葡聚糖的测定方法.本标准适用于乳及乳制品、蛋白粉、糖果、饮料中不溶性酵母β-葡聚糖的测定.
2原理
试样经蛋白酶和/或脂肪酶去除脂肪、蛋白质后，通过离心将酵母3-葡聚糖进行沉淀.沉淀后的酵母3-葡聚糖在多种酶的作用下水解为葡萄糖.利用葡萄糖氧化酶（GOD）在有氧条件下催化葡萄糖氧化，生成D-葡萄糖醛酸-d-内酯和过氧化氢，过氧化氢经过氧化物酶（POD）催化与4-氨基安替比林和对羟基苯甲酸生成红色醒亚胺（GODPOD法）.利用分光光度计在510nm波长处测定醒亚胺的吸光度. 最后通过酵母3-葡聚糖和葡萄糖的转化系数（0.9），计算得出样品中酵母3-葡聚糖的含量.
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水.
3.1试剂
3.1.1碱性蛋白酶，液体，酶活力≥240000U/ml.3.1.2中性蛋白酶液体，酶活力≥80000U/ml3.1.4脂肪酶，液体，酶活力≥20000U/mL. 3.1.3酸性蛋白酶，液体，酶活力≥50000U/mL.3.1.5乙二胺四乙酸四钠二水合物（CHNNaO2HO）.3.1.6三羟甲基氨基甲烷（tris）（CHNO）.3.1.7冰乙酸（CHCOOH）.3.1.9氯化钠（NaCl）. 3.1.8无水乙酸钠（CHCOONa）.3.1.10氢氧化钾（KOH）.3.1.11氢氧化钠（NaOH）.3.1.12盐酸（HCI). 3.1.13溶壁酶，酶活力≥200U/mg.3.1.14β-（1 6)-葡聚糖酶，酶活力≥2U/mg.3.1.15β-（1 3)-葡聚糖酶和葡萄糖苷酶混合酶，酶活力分别≥100U/mL和 20U/mL.3.1.16葡萄糖氧化酶，酶活力≥400U.3.1.184-氨基安替比林（CHsNO）. 3.1.17过氧化物酶，酶活力≥1000U.
GB 5009.303-2025
3.1.19磷酸二氢钾（KHPO）3.1.20对羟基苯甲酸（CHO）.3.1.21叠氮化钠（NaN）.3.1.22滤膜：孔径0.45pμm.
3.2试剂配制
3.2.1蛋白酶混合溶液：分别吸取2.0mL碱性蛋白酶和中性蛋白酶于5mL离心管中，混匀后，4C保存.临用现配.3.2.2氢氧化钾溶液（2.0mol/L）：称取11.2g氢氧化钾，加水溶解并稀释至100mL，混匀后，4C冷藏保存.3.2.4盐酸溶液（1.0mol/1）：称取9mL盐酸至盛有80mL水的100mL容量瓶中，充分混匀后，加水定容并混匀.3.2.5乙酸钠缓冲溶液A（0.2mol/L）：分别称取5.25g无水乙酸钠和2.16g冰乙酸至400ml.水中， 氢氧化钠溶液或冰乙酸调节pH至5.0士0.05，加水定容至500mL，并混匀.3.2.6乙酸钠缓冲溶液B（1.2mol/L)：分别称取4.96g无水乙酸钠和32.32g冰乙酸至400mL水中，氢氧化钠溶液或冰乙酸调节pH至3.8土0.05，加水定容至500mL，并混匀.3.2.7缓冲溶液C（pH7.5）：溶解1.212g三羟甲基氨基甲烷、1.169g氯化钠以及0.416g乙二胺四乙酸四钠二水合物于90mL.水中.用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH至7.5士0.05，加水定容至 100mL，并混匀.使用前，移取适量以水稀释10倍，临用现配.3.2.8溶壁酶溶液（5U/uL）：称取适量溶壁酶至缓冲溶液C中，使溶壁酶最终浓度为5U/uL.临用现配.3.2.9β-（1.6）-葡聚糖酶溶液：溶解适量3-（1.6）-葡聚糖酶于乙酸钠缓冲溶液A中，终浓度为1U/300L的悬浊液.临用现配.稀释混匀，使最终浓度分别为20U/mL和4U/mL.临用现配.使用期间应置于冰水浴中保存.3.2.11葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（GODPOD）缓冲液：向200mL容量瓶中加人160mL左右水，随后7.4士0.05.最后加人0.8g叠氮化钠，溶解后加水定容，临用现配.使用前应进行稀释，量取GODPOD 分别加人27.2g磷酸二氢钾，8.4g氢氧化钠和6.0g对羟基苯甲酸，搅拌使其完全溶解后，调节pH至缓冲液48mL至1000mL容量瓶中，加水定容至刻度，充分混匀.临用现配.3.2.12GODPOD工作液：称取400U葡萄糖氧化酶和1000U过氧化物酶和31.3mg4-氨基安替比林于1000mL容量瓶中，加人20mL稀释后的GODPOD缓冲液，轻轻晃动使充分溶解，再以GODPOD缓冲液定容，混匀后4C避光保存，临用现配.
注：3.2.8~3.2.12也可使用商品化试剂或试剂盒.
3.3标准品
3.3.1不溶性酵母p-葡聚糖参考物质[（CHO）.CAS号；9012-72-0]，纯度≥70%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品. 3.3.2无水葡萄糖（CHO，CAS号：50-99-7），纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品.
3.4标准溶液配制
3.4.1葡萄糖标准储备溶液（2.00g/L)：称取0.200g（精确至0.1mg）经过98℃~100℃干燥2h的无2
3.4.2葡萄糖系列标准工作溶液：分别量取0.6mL、1.0mL、2.5mL、4.0mL和5.0mL葡萄糖标准储 水葡萄糖，加水溶解并定容至100mL，摇匀，将溶液转移至试剂瓶.临用现配.备溶液至10mL容量瓶中，加水定容并混匀.其葡萄糖质量浓度分别为0.12g/L、0.20g/L、0.50g/L、0.80g/L和1.00g/L.临用现配.
4仪器和设备
4.1分光光度计：可测定510nm波长下的吸光度，配有1cm比色Ⅲ.4.2恒温水浴装置：40℃~80℃，精度为1.0℃. 4.3天平：感量分别为0.01g和0.1mg.4.4移液器：量程为1.00mL和200L4.5pH计：精度为0.01.4.6涡旋混合器.4.7离心机：转速可达到8000r/min. 4.8干燥箱.4.9圆孔筛；筛孔2.0mm.
5试样的制备
5.1固体样品
取固体样品5.0g~50.0g，研钵研磨粉碎后，2.0mm圆孔筛过筛后保存.注：软糖等无法粉碎的样品，应尽量剪碎.
6分析步骤
6.1基质对照样品的制备
称取3mg~10mg酵母β-葡聚糖参考物质（精确至0.0001g，与待测样品中酵母β-葡聚糖含量偏差不大于20%）于尖底离心管中，加入10.0g（精确至0.01g）相应的空白样品，充分混匀.
6.2沉淀
6.2.1液体样品
样品和制备的相应基质对照样品于15mL尖底离心管中，各加人200pL蛋白酶混合溶液（酸奶等酸性 分别称取10.0g（精确至0.01g，或相当于3mg~10mg酵母g-葡聚糖的样品质量）混匀后的液体样品加人200gL酸性蛋白酶），40℃孵育2h后冷却至室温.静置10min后，8000r/min离心5min，用滴管缓慢吸除上层脂肪和中间酶解液，保留沉淀.
6.2.2固体样品
分别称取10.0g（精确至0.01g，或相当于3mg~10mg酵母3-葡聚糖的样品质量）5.1处理后的固体样品和制备的相应基质对照样品于50mL离心管中，各加人20mL水充分溶解.再加人500μL蛋白酶混合溶液混匀，40C孵育2h后冷却至室温.静置10min后，8000r/min离心5min，用滴管缓慢吸除上层脂肪和中间酶解液，保留沉淀.
注：对于离心后没有出现酵母β-葡聚糖沉淀的样品或脂肪含量≥10%的样品，蛋白酶孵育2h后再加人500uL脂
防酶，40C孵育2h.或称取10.0g样品后，参考GB5009 88-2023中6.1.3去除样品中多余脂肪后，再用蛋白酶将蛋白质水解.
6.3沉淀清洗
慢吸除上清液，沉淀清洗需重复3次以上，直至上清液按照6.4的方法无葡萄糖检出，则底部沉淀可以 向6.2处理后的沉淀中加人5mL水，充分分散，静置10min后，8000r/min离心5min，用滴管缓进行下一步酶解.
6.4上清液的测定
3mLGODPOD工作液，40C水浴20min.移出水浴锅，冷却至室温后，转移至1cm比色Ⅲ中，以 移取适量经6.3步骤处理后的上清液0.45pm滤膜过滤后，移取100pL至5mL离心管中，各加人GODPOD工作液为空白用分光光度计在510nm处测量吸光度，并记录，用标准曲线计算试样溶液中葡萄糖的浓度，
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6.5.1样品和基质对照样品
向6.3处理后的样品和基质对照样品中加人400uL冷的氢氧化钾溶液，并冰水浴20min，冰水浴溶壁酶溶液，记录此时总体积分别为V和V.将反应液在50C恒温水浴锅中孵育12h~18h后，冷 期间多次短时涡旋至全部沉淀分散且无可见结块后，加人1.6mL乙酸钠缓冲溶液B，随后加入500gL却至室温.分别移取150pL（V：和V）该酶解液至2mL离心管中，加入300μLβ-（1 6)-葡聚糖酶溶液，80℃孵育15min后，冷却至室温.再加人300gL混合酶溶液，记录总体积分别为V，和V，40℃孵育1h后，冷却至室温.移取适量溶液经0.45um滤膜过滤后进行检测.
6.5.2酶空白溶液
移取200uL氢氧化钾溶液至5mL离心管中，加人0.8mL乙酸钠缓冲溶液B，混匀后移取120L加人2mL离心管中，加人30L溶壁酶溶液，混匀.50C孵育12h~18h后，冷却至室温.再加人300pLβ-（1 6)-葡聚糖酶溶液，80℃孵育15min后，冷却至室温.最后加人300gL混合酶溶液，40℃孵育1h，冷却至室温.移取适量溶液，经0.45um滤膜过滤后进行检测.
6.6测定
6.6.1标准曲线的绘制
分别移取100L葡萄糖系列标准溶液至5mL离心管中，各加人3mLGODPOD工作液，40C水浴20min，移出水浴，冷却至室温后，移取适量溶液经0.45μm滤膜过滤后转移至1cm比色Ⅲ中，以GODPOD工作液为空白，用分光光度计在510nm处测量吸光度，并记录.以吸光度为纵坐标，以系列标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线.
6.6.2样品溶液的测定
分别移取100uL经6.5步骤处理后的样品溶液、基质对照样品溶液、酶空白溶液，至5mL离心管中，各加人3mLGODPOD工作液，40C水浴20min.移出水浴，冷却至室温后，转移至1cm比色Ⅲ中，以GODPOD工作液为空白用分光光度计在510nm处测量吸光度，并记录.用标准曲线计算试样溶液中葡萄糖的浓度，可根据具体试样进行稀释（f).
