中华人民共和国水产行业标准
蛙脑膜炎诊断方法
Diagnostic methods forfrog meningitis
中华人民共和国农业农村部 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出.
本文件起草单位：浙江省淡水水产研究所、全国水产技术推广总站.
红、尹文林. 本文件主要起草人：潘晓艺、张翔、蔺凌云、沈锦玉、蔡晨旭、姚嘉资、袁雪梅、黄雷、陈静、彭先启、黄小
蛙脑膜炎诊断方法
1范围
本文件描述了蛙脑膜炎（frogmeningitis）诊断的试剂和材料、仪器设备、临床症状、样品，以及组织病理检测、套式PCR检测、染料法gPCR检测和综合判定的方法.
本文件适用于米尔伊丽莎白菌引起的蛙脑膜炎的流行病学调查、诊断、检疫和监测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7011.1水生动物疾病术语与命名规则第1部分：水生动物疾病术语SC/T7011.2水生动物疾病术语与命名规则第2部分：水生动物疾病命名规则
3术语和定义
3. 1
蛙脑膜炎frogmeningitis
nigromacularus）和棘胸蛙（Quasipaaspinosa）等蛙类，造成平衡机能失调、歪头、眼膜发白等症状的疾病. 由米尔伊丽莎白菌（Elizaberhkingiamiricola）感染牛蛙（RanacaLesbeiana）、黑斑蛙（Pelophylax
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.
bp:碱基对(base pair)Ct：阔值循环数，即荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数（cyele-thresholdvalue）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）dNTPs：脱氧核糖核甘三磷酸混合物（deoxy-ribonucleoside triphosphate mixture）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） EDTA;乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)qPCR:实时荧光定量 PCR(quantitative real-time PCR)Taq:水生栖热菌（Thermusaquaticus）TE:Tris-EDTATris：三羟甲基氨基甲烷（tris hydroxymethyl aminomethane)
5试剂和材料
5.1水：符合GB/T6682中一级水的规格.5.2乙醚：分析纯.5.3氯仿：分析纯.5.4异戊醇：分析纯.
SC/T 7246-2025
5.5二甲苯：分析纯，5.6石蜡：病理级.5.7粘片剂：生化试剂，避光室温保存.5.8中性树胶：生化试剂，室温保存. 5.9琼脂糖：电泳级.5.10无水乙醇：分析纯.5.11乙酸铵：分析纯.5.12苏木精染色液：生化试剂，室温保存.5.130.5%伊红染色液：生化试剂，室温保存.5.144%多聚甲醛固定液：生化试剂，室温保存.5.1575%乙醇：生化试剂，室温保存. 5.16Tris饱和酚（pH>7.8）：生化试剂，避光4C保存.5.17TaqDNA聚合酶（5U/uL）：商品化试剂，-20C保存.5.18dNTPs（各2.5mmol/L）：生化试剂，20C保存.5.1910×PCR缓冲液（无Mg）：生化试剂，-20C保存.5.20MgCl（25mmol/L)：生化试剂，-20C保存.5.21DNA Marker:生化试剂，-20C保存.5.22核酸染料：生化试剂，4C保存. 5.232×SYBR Green qPCR预混液：商品化试剂.-20C保存.5.24酚/氯仿/异戊醇混合液：将Tris饱和酚、氯仿、异戊醇按体积比25：24：1混匀，4C保存.5.25氯仿/异戊醇混合液：将氯仿、异戊醇按体积比24：1混匀，4“C保存.5.26抽提缓冲液：按A.1配制.5.27蛋白酶K（20 mg/mL):按A.2配制.5.28乙酸铵（10 mol/L):按A.3配制.5.29TE缓冲液(pH 8.0)：按A.4配制.5.3050×电泳缓冲液：按A.5配制. 5.311×电泳缓冲液：按A.6配制.5.326×载样缓冲液：生化试剂，室温保存.5.33套式PCR引物：20C保存.第一轮PCR引物分别是EMi-576F1和EMi-576R1.扩增E.miricofalepA基因中的576bp片段（见附录B中的B.1）;第二轮PCR引物分别是EMi-308F2和EMi308R2，从该片段中再扩增308bp的片段.引物序列如下：EMi-576F1;5'AACCGCAATATCAAACTGTTGTCTA-3' ; EMi-576R1:5'-TGTGGATTCCTTGGAATGCTG-3′;EMi-308F2:5'-AACCGCAATATCAAACTGTTGTCTA-3' ;EMi-308R2:5'-GTGAAATCGTTAACCAAAGTTATTTG-3' 5.34染料法qPCR引物：20C保存.扩增引物分别是EMi-q137F 和 EMi-g137R，扩增E.miricolalepA基因中的137 bp片段（见B.2）： EMi-q137F:5′-CTCCTTCACATGCAGCGATT-3′;EMi-q137R:5'-AATTACTATTAAAAGCCACGCAATTCAA-3'.5.35阳性对照：米尔伊函莎白菌菌液，一20℃保存.5.36阴性对照：未感染伊丽莎白菌的蛙组织，一20C保存.5.37空白对照：水. 2
