中华人民共和国国家标准
GB/T 36194-2018
Detection method of goldfish haematopoietic necrosis virus
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本标准由中华人民共和国农业农村部提出.本标准起草单位：全国水产技术推广总站、中国检验检疫科学研究院、北京出人境检验检疫局. 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口.本标准主要起草人：李清、王娜、谷强、张曼、景宏丽、吴绍强、张利峰、江育林、陈浩楠.
金鱼造血器官坏死病毒检测方法
1范围
本标准规定了金鱼造血器官坏死病毒（鲤疱疹病毒2型）的PCR检测、荧光PCR检测和综合判定方法.
本标准适用于金鱼造血器官坏死病毒的鉴定，用于金鱼造血器官坏死病毒引起的相关疾病的流行病学调查、诊断、检疫和监测.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范
3缩略语
CyHV：鲤疱疹病毒（cyprinid herpesvirus) 下列缩略语适用于本文件.CyHV-2:鲤疱疹病毒2型（cyprinid herpesvirus 2）GFHNV：金鱼造血器官坏死病毒（goldfish haematopoietic necrosis virus）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）bp:碱基对(base pair) Ct:循环阔值（cyele threshold)CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrimethylammonium bromide）EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid)Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl)aminomethane]
4试剂和材料
除非另有说明，仅使用分析纯试剂.
4.1水：应符合GB/T6682中一级水的规格，
4.3dNTP:含 dCTP、dGTPdATP、dTTP各10 mmoL/L 20C保存.
4.4引物：浓度为10pmoL/L，-20℃保存.
a）CyHV引物1)CyHVpol-F;5'-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3 2)CyHVpol-R;5'-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3
4.5无水乙醇：使用前预冷到一20℃.
5器材和设备
5.1生物安全柜.5.2超低温冰箱及普通冰箱.5.3离心机及离心管.5.4高压灭菌锅. 5.5组织研磨器.5.6PCR仪.5.7电泳仪5.8荧光PCR仪.5.9凝胶成像仪.
6临床症状
参见附录A
7采样
7.1采样部位
采集待测鱼的鳃、脾、肾等.
7.2采样数量
采样数量应符合SC/T7103的要求.
7.3样品采集
按GB/T18088的规定执行，且体长≤4cm的鱼苗取整条，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊；4cm<体长<6cm的鱼苗取内脏；体长≥6cm的鱼则取鳃、脾、肾.成熟雌鱼还需取卵巢液：鱼卵则取 卵膜. 8病毒的检测 8.1设立对照 从提取样品DNA起，均需设立阳性样品对照、阴性样品对照和空白对照.取已知阳性样品的组织作为阳性对照，取GFHNV检测阴性的组织作为阴性对照，取等体积的无菌去离子水作为空白对照. 8.2DNA抽提 取25mg~100mg样品，加人150 gLCTAB溶液（见B.1)，将样品匀浆，转人1.5mL的离心管中，再加CTAB溶液至900pL.25C作用2h~2.5h. 离心5min取上层水相（约 800pL），再加人700μL抽提液l（见B.3），充分混合至少30s.12000r/min， 在含有样品的离心管中加人600L抽提液I（见B.2），充分混合不少于30s.12000r/min，4℃C，倒数次混匀后，一20℃8h以上沉淀核酸.12000r/min，4℃，离心30min，小心弃去上清.干燥后加20pL水溶解，用作PCR模板. 也可使用同等抽提效果的商品化试剂盒或其他方法抽提病毒DNA. 8.3PCR检测 8.3.1反应体系 TagDNA聚合酶0.5pL模板2.5pL，加水至总体积为50pL.腾时离心将反应管置于PCR仪. 8.3.2反应条件 94C预变性5 min;94 C 1 min、55C（CyHV 引物）或60C（CyHV-2引物）1 min、72℃C 1 min，扩增35个循环：72C延伸10min，最后4C保温. 8.3.3琼脂糖电泳 用1×电泳缓冲液（见B.5）配制2%的琼脂糖凝胶（含0.5pg/mLEB，见B.6，或其他等效商品化试剂）.将5μL样品和1μL6×上样缓冲液（见B.7）混匀后加入样品孔，在电泳时设立DNA标准分子量作对照.5V/cm电泳约0.5h，当溴酚蓝到达底部时停止将凝胶置于凝胶成像仅上观察. 8.3.4测序 取PCR产物进行基因序列测定，将测序结果与DNA序列数据库（GenBank）中参考序列（参见附录C)进行同源性比对. 8.3.5结果判定 没有该条带.待测样品扩增出362bp的条带，且基因序列测定结果与参考序列相似性在99%以上者， 利用CyHV引物进行PCR扩增后，阳性对照会出现362bp的特异性条带，阴性对照和空白对照均可判定待测样品PCR检测结果为阳性；未扩增出条带或条带大小不是362bp均判定为PCR检测结果阴性. 利用CyHV-2引物进行PCR扩增后阳性对照会出现366bp的特异性条带，阴性对照和空白对照均没有该条带.待测样品扩增出366bp的条带，且基因序列测定结果与参考序列相似性在99%以上
