中华人民共和国国家标准
GB 4789.30-2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局 发布
前言
菌检验》.
本标准与GB4789.30-2010相比，主要变化如下：修改了范围.
食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验
1范围
本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Lixteriamonocytogenes）的检验方法.
本标准第一法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验：第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数；第三法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低（<100CFU/g）而杂菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数，特别是牛奶、水以及含干扰菌落计数的颗粒物质的食品. 2设备和材料 2.1冰箱：2℃~5℃. 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.2恒温培养箱：30℃士1℃、36℃C士1℃2.3均质器.2.5电子天平：感量0.1g. 2.4显微镜：10x~100x.2.6锥形瓶：100mL、500mL.2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头.2.8无菌平ml：直径90mm.2.9无菌试管：16mm×160mm. 2.10离心管：30mm×100 mm.2.11无菌注射器：1mL.2.12单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19111或CMCC54004，或其他等效标准菌株.2.14伊氏李斯特氏菌（Listeriaivanovi）ATCC19119，或其他等效标准菌株. 2.13英诺克李斯特氏菌（Listeriainnocua）ATCC33090，或其他等效标准菌株.2.15斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri）ATCC 35967，或其他等效标准菌株.2.16金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923或其他产β-溶血环金葡菌，或其他等效标2.17马红球菌（Rhodococcus equi）ATCC6939或NCTC 1621，或其他等效标准菌株. 准菌株.2.18小白鼠：ICR体重18g~22g.2.19全自动微生物生化鉴定系统. 3培养基和试剂 3.1含0.6%酵母浸膏的胰酪陈大豆肉汤（TSB-YE）：见A.1. 3.2含0.6%酵母浸膏的胰酪陈大豆琼脂（TSA-YE）：见A.2.3.3李氏增菌肉汤LB（LB，LB）：见A.3.3.41%盐酸吖啶黄（acriflavineHCl）溶液：见A.3.2.1、A.3.2.2. 3.51%萘啶酮酸钠盐（naladixicacid）溶液：见A.3.2.1、A.3.2.2.3.6PALCAM琼脂：见A.4.3.7革兰氏染液：见A.5.3.9缓冲葡萄糖蛋白陈水[甲基红（MR）和V-P试验用]：见A.7. 3.8SIM动力培养基：见A.6.3.105%~8%羊血琼脂：见A.8.3.11糖发酵管：见A.9.3.12 2过氧化氢试剂：见A.10.3.14生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统. 3.13 3李斯特氏菌显色培养基.3.15缓冲蛋白陈水：见A.11. 第一法单核细胞增生李斯特氏菌定性检验 4检验程序 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序见图1. 图1单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序 5操作步骤 5.1增菌 均质1min~2 min;或故入盛有 225mL LB增菌液的均质杯中 以8000r/min~10 000r/min均质 以无菌操作取样品25g（mL）加人到含有225mLLB增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续1 min~2min.于30C±1C培养24h±2h 移取0.1mL 转种于10mLLB增菌液内，于30℃士1℃培养24h±2h. 5.2分离 取LB：二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和PALCAM琼脂平板，于36C士1C培养24h～48h，观察各个平板上生长的菌落.典型菌落在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷：在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征，参照产品说明进行判定. 5.3初筛 自选择性琼脂平板上分别挑取3个～5个典型或可疑菌落，分别接种本糖、鼠李糖发酵管，于36C士1C培养24h土2h，同时在TSA-YE平板上划线，于36C士1℃培养18h~24h，然后选择木 糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定. 5.4鉴定（或选择生化签定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等） 5.4.1染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4μm~0.5pm）×（0.5pm~2.0pm）；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动. 5.4.2动力试验：挑取纯培养的单个可疑菌落穿剩半固体或SIM动力培养基，于25℃～30C培养48h，李斯特氏菌有动力，在半固体或SIM培养基上方呈伞状生长，如伞状生长不明显，可继续培养5d，再观察结果. 5.4.3生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验.单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1. 种到血平板上，每格剩种一个菌落，并刺种阳性对照菌（单增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36C土1C培养24h~48h，于明亮处观察，单增李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、明亮的溶血周，斯氏李斯 特氏菌在剩种点周围产生弱的透明溶血阔，英诺克李斯特氏菌无溶血圈，伊氏李斯特氏菌产生宽的、轮清晰的β-溶血区域，若结果不明显，可置4C冰箱24h~48h再观察. 注：也可用划线接种法. 5.4.5协同溶血试验cAMP（可选项目）：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球 菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，距离1mm～2mm，同时接种单核细胞增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌，于36C士1℃培养24h~48h.单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约2mm的β-溶血增强区域，斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域，伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌处出现约5mm～10mm的"箭头状"p-溶血增强区域，英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象.若结果不明显，可置 4C冰箱24h~48h再观察. 注：5%一~8%的单核细胞增生李斯特氏菌在马红球菌一编有溶血增强现象.
