中华人民共和国粮食行业标准
粮油检验 粮食中赭曲霉毒素A的测定 超高效液相色谱法
Inspection of grain and oils-Determination of ochratoxin A in grains-Ultra-high performance liquid chromatography
国家粮食局发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由国家粮食局提出. 本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAT/TC270）归口本标准起草单位：国家粮食局科学研究院、吉林省粮油卫生检验监测站、遂宁市粮食质量监督检验站、北京农业质量标准与检测技术研究中心.本标准主要起草人：谢刚、黎睿、李丽、王松雪、辛媛媛、叶金、徐振斌、李小明、王媛媛、陆安祥.
粮油检验粮食中赭曲霉毒素A的测定 超高效液相色谱法
1范围
本标准规定了粮食及其制品中赭曲霉毒素A的超高效液相色谱法测定的原理、试剂与仅器设备、分析步骤、结果计算等内容.
本标准适用于粮食及其制品中鳍曲霉毒索A的测定.
本标准方法曲霉毒素A的检出限为0.5pg/kg，定量限为1pg/kg.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T5491粮食、油料检验扦样、分样法 GB/T602化学试剂杂质测定用标准溶液的制备GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
用提取液提取试样中的曲霉毒素A，免疫亲和柱净化、富集后，超高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量.
4试剂与仪器设备
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级用水要求.
4.1试剂
4.1.2乙晴（CH CN)：色谱纯. 4.1.1甲醇（CHOH），色谱纯.4.1.3氧化钠（NaCI）：分析纯.4.1.4磷酸氢二钠（NaHPO）：分析纯.4.1.5磷酸二氢钾（KHPO）：分析纯.4.1.6氯化钾（KCI）：分析纯. 4.1.7浓盐酸（HCI）：分析纯.4.1.8乙酸（CH COOH)：色谱纯.4.1.9碳酸氢钠（NaHCO）：分析纯.4.1.10吐温-20：分析纯，4.1.11乙晴水（6040）：60体积乙晴（4.1.2）和40体积水混合. 4.1.12酸化甲醇：1体积的色谱级乙酸（4.1.8）和99体积的甲醇（4.1.1）混合.
LS/T
4.1.13真菌毒素清洗缓冲液：称取25.0g氯化钠（4.1.3）、5.0g碳酸氢钠（4.1.9）溶于水中，加人0.1mL吐温-20（4.1.10），用水稀释至1L.
4.1.14磷酸盐缓冲液：8.0g氯化钠（4.1.3）、1.2g磷酸氢钠（4.1.4)、0.2g磷酸二氢钾（4.1.5）、0.2g氯化钾（4.1.6）溶解于约990mL水中，用浓盐酸（4.1.7）调节pH至7.0，用水稀释至1L.
其他试剂应符合GB/T602的要求.
4.2标准品
4.2.1曲霉毒素A标准品：纯度>99%；或经国家认证井授权标准物质证书的标准物质.4.2.2鳍曲霉毒素A标准储备液：使用有证标准物质溶液；或准确称取适量的赭曲霉毒素A标准品 （4.2.1）.用甲醇溶解，配成浓度为100pg/L的标准储备液，一20C4.2.3曲霉毒素A标准工作溶液：准确移取适量的曲霉毒素A标准储备液（4.2.2），用流动相稀 避光保存.
释，配成浓度为1μg/1 μg/ μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/的标准工作溶液.
4.3材料与仪器设
4.3.14 调速多用振 器（振 额率≥150次），
4.3.15 空气压力泵，
4.3.16 试验筛：1mm孔径试验筛.
4.3.17 液相色谱柱：C18柱（柱长50m 或100mm挂内径2.1mm，填料粒径1.7μm），或性能相当者，
4.3.18超高效液相色谱仪：包括超高效液相色谱仪、超高压液相色谱仪和超高速液相色谱仪，配备荧 光检测器和数据处理系统.
色谱参考条件：色谱柱：C18柱（4.3.17）.柱温：35℃；流动相：乙晴水冰乙酸（961022）流速：0.3mL/min. 进样量：10μL.荧光检测器：激发波长310nm，发射波长465nm.
5分析步骤
5.1扦样与分样
按GB/T5491执行，在采样过程中，注意防止样品污染.
5.2样品制备
5.2.1提取
样品用高速粉碎机（4.3.9）粉碎，过 6）.混合均匀后，取有代表性样品不少于500g，供检测用.准确称取 0g（精确到 孔径试验师（ 匀的试样，置 于均质杯或250mL三角瓶中，加人100mL（V）乙晴水 液（4.1） ，高速均质提取2min.或者债相调速多用振荡器（4.3.14）振荡提取30min，用定性滤细 法过滤本转移25mL的提取液于50mL的离心管中，在5 000r/min下离心5min.准确移取 ）滤液或离心管上层液体加人26mL（V）磷酸盐要冲液1.14），混合均匀后，于8000r/m 离 10min，上清液备用.
5.2.2净化
将免疫和桂（4.3.1）与mL玻璃注 端连临将士选30mLcV.）的上清液分两次全部注人注射器中将空气压力 3H 与玻 器造 周节压为性落液以购1滴的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至空气进 依次 mL真菌备素清洗冲液（4.1.13）、10ml水淋洗亲和柱，弃掉量部流出液，抽干免狡系剂 柱
准确加入1.smL洗脱液1±2）全部洗脱液干净的玻璃试管中，在5 以氢吹仪用氮气次至净上准酶入0.5mL流动相溶解 存的洗 说滋造行选脱，流速为摘/s，收集残渣，涡旋混合30过0.22mm德股（1.3 4.作为待遇样液备用
注：由于不同厂商是供的影和柱操作程序可能有所不同，实际操作时，也可参展免疫系和柱商提供的操作说明和
程序使用.
5.3标准曲线的制
曲霉毒素A标准工作溶液（4 3）由低到高注人液相色谱检 分析. 储曲霉毒素A标准工作液浓度为横坐标，相对应色谱峰峰面积为织坐标，建立标准工作曲线
5.4试样溶液的测定
新按5.2进行处理符合要求后再进样分析.待测样液中赭曲霉毒素A的浓度为c1.液相色谱图详见 待测样液（5.2）中待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内，浓度超过线性范围的样品则应重附录A.
5.5空自试验
不称取试样，按5.2的步骤做空白实验，分析得到空白试样中待测物的浓度为（.
5.6平行试验
按5.2步骤，对同一试样进行平行试验测定.
