NY
中华人民共和国农业行业标准
饲料中罗丹明B和罗丹明6G的测定 高效液相色谱法
Determination ofrhodamineBandrhodamine6Ginfeeds-Highperformance liquid chromatography
中华人民共和国农业部发布
前 言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由农业部畜牧业司提出.本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）归口. 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所.本标准主要起草人：张妍、杨曙明、邱静、于洪侠、赵小阳.
饲料中罗丹明B和罗丹明6G的测定高效液相色谱法
1范围
本标准规定了饲料中罗丹明B和罗丹明6G的高效液相色谱测定法.本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中罗丹明B和罗丹明6G的测定. 本标准的定量限为1ug/kg.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备
3方法原理
饲料中的罗丹明B和罗丹明6G经过2%三氯乙酸乙晴溶液提取，正已烷脱脂，离心后上清液用氮气吹干，甲醇定容，高效液相色谱测定，外标法定量.
4试剂和材料
除特殊注明外，所用试剂均为分析纯；水应符合GB/T6682中一级用水规定；溶液按照GB/T603
的规定配制.
4.1甲醇：色谱纯.
4.2正已烷：色谱纯.
4.32%三氯乙酸乙晴溶液：取10g三氯乙酸溶于500mL乙腊中.
4.41%磷酸：取10mL磷酸，用水溶解并稀释至1000mL，
4.5罗丹明B和罗丹明6G标准品：纯度≥98%.
4.6罗丹明B和罗丹明6G贮备液（1mg/mL）：分别准确称取罗丹明B和罗丹明6G标准品10mg.用甲醇溶解，定容至10mL，贮备液在一20℃保存，有效期一年.
4.7罗丹明B和罗丹明6G标准中间液（1pg/mL):分别准确吸取1mL的罗丹明B和罗丹明6G标准贮备液，用甲醇稀释定容至100mL.2℃~8"C保存，有效期10d
4.8罗丹明B和罗丹明6G标准工作液：吸取适量的罗丹明B和罗丹明6G标准中间液，用甲酶分别配效期10d
4.9滤膜：0.22um.
5仪器和设备
5.1高效液相色语仪：配有荧光检测器.
5.2离心机：转速大于10000r/min.
NY/T 2656-2014
5.3激涡振荡器.5.4振荡器.5.5分析天平：感量0.00001g.5.6天平：感量0.01g.
6试样制备
按GB/T14699.1抽取有代表性的样品，四分法缩减取样.按GB/T20195的规定制备试样，粉碎，全部通过孔径为0.42mm的试验筛，混匀，装入密闭容器中，避光保存，备用.
7分析步骤
7.1试样提取
称取1g试样（精确至0.01g）.置于25mL离心管中；加人2%三氯乙酸乙溶液（4.3）5mL，40°℃超声提取30min：加入5mL正已烷，激涡振荡1min.在10000r/min下离心5min，将下层乙晴转移至10mL离心管中，50℃下氮气吹干，用1.0mL甲醇溶解，滤膜过滤后测定.
7.2色谱条件
色谱柱：Cs，柱长150mm，内径4.6mm，粒度5gm，或性能相当者.柱温：30℃.进样量：10pL流速：0.5mL/min. 流动相：1%磷酸乙=5050荧光检测器条件：激发波长540nm；发射波长570nm.
7.3定量测定
分别取适量的罗丹明B和罗丹明6G标准工作液（4.8）及试样溶液（7.1）测定，以色谱峰保留时间定性，以色谱峰面积响应值作单点或多点校准定量，罗丹明B和罗丹明6G标准色谱图参见附录A.
8结果计算
试样中罗丹明B或罗丹明6G的含量，以质量分数X.计，数值以微克每千克（ug/kg）表示，按式（1）计算：
A:×m
式中：
V--试样溶液的定容体积.单位为毫升（mL)； m一试样质量，单位为克（g）；C-标准工作液中相应罗丹明B或罗丹明6G的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；A--试样溶液中罗丹明B或罗丹明6G的峰面积；A：-标准工作液中相应罗丹明B或罗丹明6G的峰面积.测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字.
9重复性
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不大于其算术平均值的15%.
附录A
罗丹明B和罗丹明6G标准工作液色谱图
罗丹明B和罗丹明6G标准工作液色谱图见图A.1.
图A.1罗丹明B和罗丹明6G标准工作液色谱图（1μg/L)
