中华人民共和国农业行业标准
NY/T3799-2020
生乳及其制品中碱性磷酸酶活性的测定 发光法
Determination of alkaline phosphatase activity in raw milk and milk products-Enzymaticphoto-activated systemmethod
[ISO22160:2007/IDF 209:2007 Milk and milk-based drinks-Determinationof alkaline phosphatase activity-Enzymatic photo-activated system(EPAS)method NEQ]
中华人民共和国农业农村部发布
全国农业食品标准
本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利. 本文件的发 布 不承担识别这些专利的责任.
本标准使用重新起草法参考ISO22160：2007/IDF209007C乳和乳饮料-碱性磷酸酶活性测定-酶光活化（EPAS)方法》编制，与该ISO22160：2007/IDF209：2007的一致性程度为非等效.
本标准由农业农村部畜牧兽医局提出.
本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口.
（北京）、农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）. 本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室
本标准主要起草人：李松励、文芳、郑楠、王加启、张吴、屈雪寅、张养东、赵圣国、祝杰妹、叶巧燕、乔勤勤.
生乳及其制品中碱性磷酸酶活性的测定发光法
1范围
本标准规定了生乳及其制品中碱性磷酸酶活性测定的发光法.
本标准适用于牛、羊、水牛、耗牛等不同奶畜生乳及其制品（巴氏杀菌乳、调制乳、奶油等）中碱性磷酸酶的测定.
本标准的检出限为20mU/1. 最限为60m0
2规范性引用文件
下列文件对于本文作的应 用的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用 有的
GB/T 6682
3术语和定义
在本标准 酶的量.
4原理
底物在碱性 酶的 光信号，通过大分子增强组分 量化学发光产物的量，并转化成 HEA
5试剂或材料
5.2底物（0.2mol/L） 含1%荧光素的DEAE缓冲混 螺旋 基-1 期为6个月：若保存温度为 杂环丁烷二钠盐，溶于30°C，有效期为24h.使用时，应 底物应 持在0C~7C或置于冰1 存，
5.3终止液：称取1.337g2-氨基-2-甲基 至100ml.称取0.02g苯扎氯铵，用水溶解并定容至100ml.上述两种溶液各取50ml.，混匀，调节pH至10.7.作为底物酶水解反应的终止液.若保存温度为4℃，有效期为1年：若保存温度为室温（18℃~24℃），有效期为2个月.使用前恢复至室温.
5.4乙酸镁溶液：称取35.4g四水合乙酸镁，溶于25ml.水中.可适当加热以助于溶解.待温度冷却至室温后，定容至100ml..
5.5碱性磷酸酶校准片：由已细碱性磷酸酶含量的干燥生乳制成的片剂，碱性磷酸酶活性为（875土26）uU.使用前，用不含碱性磷酸酶的液体乳复原.在4C下保存，有效期为2年.
NY/T 3799-2020
5.6巴氏杀菌乳校准液：取3支50mL试管分别标记为A、B和C，在每个试管中用100L.水溶解一个校准片.分别向管A中加人20mL管B中加人5mL管C中加人2.5mL无磷酸酶活性的巴氏杀菌乳样品，使校准液AB和C的酶活性分别为44mU/L、175mU/L和350mU/L.盖上盖子，剧烈振荡 后，于冷藏条件下放置10min.使用前混匀.
5.7稀奶油或调制乳校准液：取3支50mL.试管分别标记为A、B和C，在每个试管中用100gL.水溶解一个校准片.分别向管A中加人10ml管B中加人5ml管C中加人2.5mL无磷酸酶活性的稀奶油或调制乳，使校准液A、B和C中酶活性分别为88mU/L、175mU/L和350mU/L.盖上盖子，剧烈振荡后，于冷藏条件下放置10min.使用前混匀.
5.8阳性质控：使用碱性确酸酶冻干粉制备阳性质控.用10ml不含磷酸酶活性的代表性乳制品或阴性试样复原，静置10min.制得含450mU/L.碱性磷酸酶的阳性质控.若保存温度为0°℃~7C，有效期为48h：若保存温度为一15℃以下，有效期为2个月.使用前恢复至室温，剧烈振荡.不宜反复冻融.
6仪器设备
6.1化学发光检测仪：540nm，配温度探针，通过内置软件将线性输出信号直接转换为酶活性，或带化学发光检测功能的酶标仪.6.2天平：感量为1mg、0.1mg.6.3移液器；100 pl、1 ml.、5 ml.6.4育器：（35±1）℃、（63土0.2）℃.6.5水浴锅：（63±0.2）℃、（95±2）℃.6.696孔酶标板：白色、不透明.
7样品
7.1试样制备
7.1.1生乳
生乳样品冷藏或冷冻保存.测定前，室温水浴解冻并混匀后，移取1mL生乳（或适量的稀释后活性小于7000mU/L）试样加人到100mL容量瓶中.用阴性试样定容至刻度，混匀.
7.1.2巴氏杀菌乳
巴氏杀菌乳样品冷藏，混匀待测.
7.1.3调制乳或稀奶油
调制乳或稀奶油根据包装要求保存，混匀.
7.1.4阴性试样
分离的乳制品，可适当降低温度并延长时间，如羊乳，可63℃保持30min.阴性试样若保存温度为0℃~ 取适量试样在95C水浴加热保持1min，然后快速冷却.对于在95C下保持1min可能发生沉淀和7℃，有效期为48h；若保存温度为一15℃以下，有效期为6个月.使用前恢复至室温，剧烈振荡.不宜反复冻融.
8
8.1带直接测定酶活性结果的内置软件的化学发光检测仪的校准
8.1.1应对每类乳制品分别进行校准，建立各种待测类型产品的校准曲线.当重新配制底物和终止液时，需重新进行校准.8.1.2设定发光检测仪，默认背景值为100，校准值为100.8.1.3用阴性试样校准：移取100ul底物至一次性带盖小管，再加人100pl.阴性试样，混匀，置于35℃的孵育器中孵育3min.在孵育结束后的15s内加人1.0mL终止液.从孵育器中取出小管，剧烈振荡 2
5s.将小管插入发光检测仪，读取并记录检测仪的读数.试验重复3次，计算阴性平均值（N）.若任何一个值与平均值的相对偏差超过30%.则按8.1.3重新测定.
8.1.4用350mU/L.校准液校准；移取100l.底物加人一次性带盖小管，再加人100pl.校准品C或
C，混匀，置于35C的孵育器中孵育3min.在孵育结束后的15s内加人1.0mL终止液.从孵育器中取出小管，剧烈振荡5s.将小管插人发光检测仪，读取并记录检测仪的读数.试验重复3次，计算平均校准值（C，）.若任何一个值与平均值的相对偏差超过30%，则按8.1.4重新测定.
8.1.5使用平均校准值C，和阴性平均值N，按式（1）计算校正值C，，按式（2）计算背景值B.参阅光度检测仪手册将校正值C，输入检测仪中，建立新的校正值，背景值B.输人光度计成为新的背景值.
8.1.6再次用阴性试样校准：重复8.1.3的操作.验证巴氏杀菌乳阴性试样的碱性磷酸酶活性是否小于5mU/L.调制乳和奶油阴性试样的碱性磷酸酶活性是否小于15mU/L..若平均值超出范围，从8.1.3开始重新测定.
8.1.7再次用350mU/1.校准液校准：重复8.1.4的操作.验证校准品平均值是否在320mU/1.~400mU/L范围内.若任何一个值与平均值的相对偏差超过30%，从8.1.4开始重新测定.
8.1.8用44mU/1.或88mU/L.校准液校准：参照8.1.4的操作，将加人100gL校准品C或C更改为加人100gl.校准品A或A，其余操作步骤同8.1.4.验证44mU/L.的校准液平均值是否在32mU/L~55mU/1，或88mU/1.校准品平均值是否在45mU/L~110mU/L范围内.若任何一个值与平均值的 相对偏差超过40%，则按8.1.8重新测定.
8.1.9用175mU/1.校准液校准：参照8.1.4的操作，将加人100L校准液C或C更改为加人100gl校准品B或B.验证175mU/L.校准品平均值是否在145mU/L~205mU/L.范围内.若任何一个值与平均值的相对偏差超过30%，则按8.1.9重新测定.
8.1.10阴性质控检测：按测定程序81.3进行，不加待测样品.每天进行阴性质控测试，以验证光度检测仪校准和试剂性能.在适当校准的通道，若测得的碱性磷酸酶活性水平低于5mU/1.则系统通过验证.
8.1.11阳性质控检测：用阳性质控样品，参照8.1.4的操作，将加人100L.校准品C或C更改为加入100gl.阳性质控样品（5.8）.每天进行阳性质控检测，以验证光度计校准和试剂性能.阳性质控样品测定值应为300mU/L~585mU/L.若在此范围内，表明校准完成，可进行样品测定，且本次校准对于该批8.1.3开始重新校准光度检测仪. 次底物和终止液有效；若超出范围，重新配制阳性质控样品，按8.1.11重新测定：若仍然超出范围，从
8.2具有化学发光检测功能的酶标仪校准
移取100pl底物至一次性带盖小管，加人100pl校准液（碱性磷酸酶活性分别为0mU/144mU/1.、175mU/L、350mU/L、450mU/L），混匀，置于35C的孵育器中孵育3min.孵育结束后，15s内加人1.0mL终止液.从孵育器中取出小管，并剧烈振荡5s.将小管内的液体转移至96孔酶标板的 板孔中，放入酶标仪进行测定.记录相对发光强度RLU值，以RLU值为纵坐标、碱性磷酸酶活性为横坐标，绘制标准曲线.
8.3样品测定
移取100L底物加人一次性带盖小管，再加人100pl待测样品，混匀，置于35C的孵育器中孵育3min.孵育结束后，15s内加入1.0mL.终止液.从孵育器中取出小管，并剧烈振荡5s.将小管插入化 学发光光度计，读取并记录光度计的读数，或将小管内的液体转移至96孔酶标板的板孔中，放人酶标仪进行测定.若测定值超过7000mU/L.，将样品稀释后重新测试.
8.4阳性样品确证
若样品中碱性磷酸酶活性的测定结果≥350mU/1.，则样品疑似阳性，需经过试验（8.5和8.6）确认是否为耐热微生物型碱性磷酸酶或复活型碱性磷酸酶.
8.5耐热微生物型碱性磷酸酶
