ICS 71.040.40CCS X 41
中华人民共和国农业行业标准
硒蛋白中硒代氨基酸的测定 液相色谱原子荧光光谱法
Determination ofselenoamino acidinselenoprotein-Liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry
中华人民共和国农业农村部发布
起草. 本文件按照GB/T1.1- 规则》的规定
本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口.
本文件起草单位：恩施土家族苗族自治州农业科学院、武汉大学、中硒健康产业投资集团股份有限公司.
本文件主要起草人：陈永波、刘淑琴、李卫东、黄光显、张朝阳、胡中立、陈娥、胡百顺、秦邦、刁英、熊倩、朱云芬、瞿勇、田宗仁、新素荣.
硒蛋白中硒代氨基酸的测定 液相色谱原子荧光光谱法
1范围
本文件规定了液相色谱-原子荧光光谱法测定硒蛋白中水解硒代氨基酸的方法.
本文件适用于硒蛋白水解后硒代氨基酸[晒代胱氨酸（SeCys）、甲基-语代半胱氨酸（MeSeCys）和晒代甲硫氨酸（SeMet）含量之和]的测定.
本方法的检出限分别为SeCy0.070mg/kg MeSeCys0.032mgkg、SeMet 0.14mg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的内容 通过 面成 中，注日期的引用文件，仅注该日期对应的版本适用 期的学 用文排 的修改单）适用于本文件.
GB 1903. 28- -201 强化
3术语和定义
硒蛋白 seclenoproel
以含晒量较高 食 正 制而成的富含硒代氨基酸的食品营 养强化插
硒代氨基酸
硒蛋白水解后
4原理
硒蛋白经盐酸水解后 解成S 等含晒氨基 色谱柱分离后由原子荧光光谱仪测定.峰面积与溶液 检测 呈正 时间定 标法定量.
5试剂或材料
除非另有说明，本文件所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
5.1试剂
5.1.2甲酸（HCOOH）.5.1.7磷酸氢二铵[（NH）HPO.].
5.1.1盐酸（HCI)：优级纯.
5.1.3氯氧化钾（KOH）.
5.1.4氢氧化钠（NaOH）.
5.1.5碘化钾（K1）.
5.1.6硼氢化钾（KBH）.
NY/T 3870-2021
5.2溶液配制
5.2.1盐酸溶液（6mol/L)：量取500ml.盐酸（5.1.1).用水定容至1000 ml.. 5.2.2磷酸氨二铵溶液（40mmol/L.pH=6.0）：称取5.282g磷酸氢二铵（5.1.7）溶于水中，加水至约950mL..用甲酸（5.1.2）调节pH=6.0.用水定容至1000ml，0.45pm滤膜（水相）过滤，超声脱气2 min~3 min 5.2.32%碘化钾0.5%氢氧化钾溶液：称取20.0g碘化钾（5.1.5）、5.0g氢氧化钾（5.1.3），用水定容至1000ml.水定容至1000ml.5.2.5盐酸溶液（10%）：量取100ml盐酸（5.1.1），用水定容至1000mL.5.2.6氢氧化钠溶液（6mol/L）：称取氢氧化钠（5.1.4）24g.用水定容至100ml.5.2.7氢氧化钠溶液（1mol/L)：称取氢氧化钠（5.1.4）4g.用水定容至100ml
5.3标准品
5.3.1硒代胱氨酸标准溶液（GBW10087）. 5.3.2甲基-硒代半胱氨酸标准溶液（GBW10088）.5.3.3硒代甲硫氨酸标准溶液（GBW10034）.
5.4标准溶液配制
5.4.1硒代胱氨酸标准储备溶液：将硒代胱氨酸标准溶液（5.3.1）2mL转人10mL容量瓶中.用水定容至10ml..5.4.2甲基-硒代半胱氨酸标准储备溶液：将甲基-硒代半胱氨酸标准溶液（5.3.2）2mL.转入10ml.容量5.4.3硒代甲硫氨酸标准储备溶液：将硒代甲硫氨酸标准溶液（5.3.3）2mL.转人10ml.容量瓶中，用水 瓶中.用水定容至10ml定容至10ml注：此标准储备溶液在4C冰箱中保存，有效期为1个月5.4.4吸取5.4.1~5.4.3的标准储备液各1.00mL.于10mL容量瓶中，用水定容，配置成混合标准工作液.
6仪器设备
6.1高效液相-原子荧光联用仪（带阴离子交换柱和硒空心阴极灯）.6.2微波蛋白水解仪.6.3分析天平：感量0.01g和感量0.0001g. 6.4电位滴定仅或pH计.6.5溶剂过滤装置.注：实验中所用玻璃器Ⅲ、石英杯均需以硝酸溶液（V硝酸：V水=1：4）浸泡过夜，用水冲洗干净.
7试验步骤
7.1试样保存
待检、已检硒蛋白样品需装在锡箔或铝箔包装袋中，放人4C冰箱中保存.
7.2试样制备
称取试样20mg（精确到0.1mg）于微波蛋白水解仪（6.2）配套的内插杯内，加入1mL6mol/L盐酸溶液（5.2.1）.置于微波蛋白水解仪中150C水解40min，水解液转移至小烧杯中.用6mol/L.氢氧化钠溶液（5.2.6）和1mol/L氢氧化钠溶液（5.2.7）调节pH至7.5，转移到25ml.容量瓶中.加水定容后用 0.45μm滤膜过滤，待测.同时做空白实验.
7.3标准曲线制作
将SeCys、MeSeCys 和 SeMet 的混合标准工作溶液（5. 4. 4）0 uL、10 prl.、20 l.、30μl、40pL、50pl分别导入仅器，测定其色谱峰，以Se含量为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线.仪器条件参照附录 A.硒代氨基酸标准溶液色谱图见附录B中的B1.
7.4试样测定
器，测定其峰面积，以保留时间定性，外标法定量，硒蛋白水解液色谱图见附录B中的B2.
8试验数据处理
晒蛋白中SeCys、MeSeCys和SeMet的含量（以晒计）按公式（1）计算；硒代氨基酸总量等于样品中SeCys、MeSeCys和SeMet含量（以硒计）之和，按公式（2）计算.
TsAAXXX .(2)
式中：
Xs 试样中确代氨基酸含量的数值（以晒计），单位为毫克每千克（mg/kg）：X 试样中SeCys含量的数值（以晒计），单位为毫克每千克（mg/kg）： 试样中MeSeCys含量的数值（以硒计），单位为毫克每千克（mg/kg）；X. 试样中SeMet含量的数值（以晒计）.单位为毫克每千克（mg/kg）；M 试样中晒代氨基酸质量的数值（以硒计）.单位为纳克（ng）；M 试样质量的数值，单位为毫克（mg）； 样品空白中硒代氨基酸质量的数值（以硒计），单位为纳克（ng）：V m 水解液体积的数值，单位为毫升（mL）；V: 进样体积的数值，单位为微升（L）；Ts 硒代氨基酸之和（以晒计）.单位为毫克每千克（mg/kg）.结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，保留3位有效数字.
9精密度
在重复性条件下获得的2次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10%，以大于算术平均值10%的情况不超过5%为前提.
