水产品中孔雀石绿的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201701）
1范围
本方法规定了水产品及其养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的胶体金免疫层析快速检测方法.
本方法适用于鱼肉及养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的快速测定.
2原理
样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿经有机试剂提取，吸附剂净化，正已烷除脂后，加入氧化剂将隐色孔雀石绿氧化成为孔雀石绿，经浓缩复溶后，孔雀石绿与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化.通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量进行定性判定.
3试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水.
3.1试剂
3.1.1正已烷.3.1.2乙.3.1.3冰乙酸.3.1.4盐酸. 3.1.5吐温-20.3.16氯化钠.3.1.7对-甲苯磺酸.3.1.9盐酸羟胺. 3.1.8无水乙酸钠.3.1.10无水硫酸钠.3.1.11中性氧化铝：层析用，100目~200目.3.1.12二氯二氰基苯配.3.1.13氯化钾. 3.1.14磷酸二氢钾.3.1.15十二水合磷酸氢二钠.3.1.16饱和氯化钠溶液：称取氯化钠（3.1.6）200g，加水500mL，超声使其充分溶解.
3.1.17盐酸羟胺溶液（0.25g/mL）：称取2.5g盐酸羟胺（3.1.9），用水溶解并稀释至10mL， 混匀.3.1.18乙酸盐缓冲液：称取4.95g无水乙酸钠（3.1.8）及0.95g对-甲苯磺酸（3.1.7）溶解于950mL水中，用冰乙酸（3.1.3）调节溶液pH为4.5，用水稀释至1L，混匀.棕色容量瓶中，用乙晴（3.1.2）溶解并稀释至刻度，混匀.4C避光保存. 3.1.20复溶液：称取8.00g氯化钠（3.1.6），0.20g氯化钾（3.1.13），0.27g磷酸二氢钾（3.1.14）及2.87g十二水合磷酸氢二钠（3.1.15）溶解于900mL水中，加入0.5mL吐温-20（3.1.5），混匀，用盐酸（3.1.4）调节pH为7.4，用水稀释至1L，混匀.
3.1.19二氯二氰基苯醒溶液（0.00lmol/L）：称取0.0227g二氯二氰基苯醒（3.1.12）置于100mL
3.2参考物质
孔雀石绿、隐色孔雀石绿参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度均≥90%.
表1孔雀石绿、隐色孔雀石绿参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量
序号 CAS登录号 分子式 相对分子质量中文名称 孔雀石绿 MalachiteGreen 英文名称 569-64-2 C2H2sCIN 192隐色孔雀石绿 LeualachiteGreen 129-73-7 C2HN 330.47
注：或等同可溯源物质.
3.3标准溶液配制
3.3.1孔雀石绿、隐色孔雀石绿标准储备液（1mg/mL）：精密称取适量孔雀石绿、隐色孔雀石绿参考物质（3.2.1），分别置于10mL容量瓶中，用乙腊（3.1.2）溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成浓度为1mg/mL的孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准储备液.-20C避光保存，有效期1个月.
3.3.2孔雀石绿标准中间液A（1μg/mL）：精密量取孔雀石绿标准储备液（1mg/mL）（3.3.1）0.1mL，置于100mL容量瓶中，用乙腊（3.1.2）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为lμg/mL的孔雀石绿标准中间液A.临用新制.
3.3.3孔雀石绿标准中间液B（100ng/mL）：精密量取孔雀石绿标准中间液A（1μg/mL）（3.3.2）ImL，置于10mL容量瓶中，用乙腊（3.1.2）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100ng/mL的孔雀 石绿标准中间液B.临用新制.
3.3.4隐色孔雀石绿标准中间液A（lμg/mL）：精密量取隐色孔雀石绿标准储备液（lmg/mL）（3.3.1）0.1mL，置于100mL容量瓶中，用乙（3.1.2）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1μg/mL的隐色孔雀石绿标准中间液A.临用新制.
3.3.5隐色孔雀石绿标准中间液B（100ng/mL）：精密量取隐色孔雀石绿标准中间液A（1pg/mL）（3.3.4）1mL，置于10mL容量瓶中，用乙（3.1.2）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100ng/mL的隐色孔雀石绿标准中间液B.临用新制.
3.4材科
3.4.1免疫胶体金试剂盒，适用基质为水产品或水.3.4.1.1金标微孔.3.4.1.2试纸条或检测卡.
4仪器和设备
4.1移液器：200uL、1mL和10mL.4.2涡旋混合器.4.5氮吹浓缩仪.4.6环境条件：温度15℃-35℃，湿度≤80%.
4.3离心机：转速≥4000r/min.
4.4电子天平：感量为0.01g.
5分析步骤
5.1试样制备
取适量有代表性样品的可食部分或养殖用水，固体样品充分粉碎混匀，液体样品需充分混匀.
5.2试样的提取与净化
5.2.1水产品
准确称取试样2g（精确至0.01g）置于15mL具塞离心管中，用红色油性笔标记，依次加入1mL饱和氯化钠溶液（3.1.16），0.2mL盐酸羟胺溶液（3.1.17），2mL乙酸盐缓冲液（3.1.18）及6mL 乙晴（3.1.2），涡旋提取2min.加入1g无水硫酸钠（3.1.10），1g中性氧化铝（3.1.11），涡旋混合1min，以4600r/min离心5min.准确移取5mL上清液于15mL离心管中，加入1mL正已烷（3.1.1），充分混匀，以4600r/min离心1min.准确移取4mL下层液于15mL离心管中，加入100uL二氯二氰基苯醒溶液（3.1.19），涡旋混匀，反应1min，于55C水浴中氮气吹干.精密加入200uL复溶液（3.1.20），涡旋混合1min，作为待测液，立即测定.
5.2.2养殖用水
量取试样2mL置于离心管中，以4600r/min离心5min，移取200gL上清液作为待测液.
5.3测定步骤
5.3.1试纸条与金标微孔测定步骤
吸取全部样品待测液于金标微孔（3.4.1.1）中，抽吸5-10次使混合均匀，室温温育3一5min，将试纸条（3.4.1.2）吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育5-8min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定.
5.3.2检测卡与金标微孔测定步骤
吸取全部样品待测液于金标微孔（3.4.1.1）中，抽吸5-10次使混合均匀，室温温育3一5min，将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡（3.4.1.2）上的加样孔中，温有5一8min，进行结果判定.
5.4质控试验
每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验.
5.4.1空白试验
称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作.
雀石绿标准中间液B（100ng/mL）（3.3.3），使孔雀石绿浓度为2μg/kg，按照5.2和5.3步骤与样 准确称取空白试样2g或适量（精确至0.01g）置于15mL具塞离心管中，加入100uL或适量孔品同法操作.
准确称取空白试样2g或适量（精确至0.01g）置于15mL具塞离心管中，加入100uL或适量隐色孔雀石绿标准中间液B（100ng/mL）（3.3.5），使隐色孔雀石绿浓度为2ug/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作.
5.4.2.2养殖用水
准确量取空白试样2mL（精确至0.01g）置于15mL具塞离心管中，加入100uL孔雀石绿标准中间液B（100ng/mL）（3.3.3），使孔雀石绿浓度为2ug/L，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作.
6结果判定要求
通过对比控制线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定.目视判定示意图见图1.
6.1无效
控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效.
6.2阳性结果
检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量高于方法检测限，判定为阳性.
6.3阴性结果
检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量低于方法检测限，判定为阴性.
a)试纸条
无效
阴性
b)检测卡
图1目视判定示意图
6.4质控试验要求
空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应均为阳性.
7结论
孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量以孔雀石绿计，当检测结果为阳性时，应对结果进行确证.
8性能指标
8.1检测限：水产品2ugkg，养殖用水2ug/L.
8.2灵敏度：灵敏度应≥99%
8.3特异性：特异性应≥85%.
8.4假阴性率：假阴性率应≤1%.
8.5假阳性率：假阳性率应≤15%.
注：性能指标计算方法见附录A.
9其他
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定.方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法 规定的各项性能指标.
本方法参比标准为GB/T19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》或的修改单）.
本方法使用试剂盒可能与结晶紫和隐色结晶紫存在交叉反应，当结果判定为阳性时应对结果进行确证.
