中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4807-2017
进出口食用动物、饲料中杆菌肽的 检测方法
Determination of bacitracin in animals and feeds for import and export
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局.本标准主要起草人：张晓文、张晓梅、郑小龙、刘靖靖、王凤美、王群、王培峰、张金玲.
进出口食用动物、饲料中杆菌肽的 检测方法
1范围
本标准第一法规定了进出口食用动物血液和饲料中杆菌肽A的液相色谱串联质谱测定方法，第二法规定了进出口食用动物和饲料中杆菌肽的ELISA检测方法
本标准适用于进出口食用动物（猪、牛、羊、禽）血液和饲料中杆菌肽的测定.
本标准适用于出入境检验检疫工作
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的：凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
第一法进出口食用动物血液和饲料中杆菌肽A检测方法一液相色谱串联质谱法
3方法提要
试样经粉碎、均质后，用甲醇-甲酸水溶液提取样品中的杆菌肽入残留.用固相萃取小柱净化，液相色谱-串联质谱测定，外标法定量.
4试剂
除非另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6582规定的一级水
4.4甲醇：色谱纯.
4.6甲酸：色谱纯.
4.71.5mmol/LEDTA溶液：称取0.5gEDTA于容量瓶中.加水定容至1000ml
4.81%TCA溶液：称取10.0gTCA于容量瓶中，加水定容至1000mL.
4.90.1%的甲酸-水溶液：移取1mL甲酸于容量瓶中，加水定容至1000mL.
4.104%三氯乙酸-乙晴溶液：移取4mL二氯乙酸于容量瓶中，乙晴定容至100mL.
4.11定容液：0.1%甲酸-水溶液利乙請体积比为8：2.
4.12杆菌肽A标准品：纯度≥96.0%
SN/T 4807-2017
此储备液可在一18℃以下避光存放12个月.4.14标准中间液：准确吸取杆菌肽A标准储备液500μL甲醇定容至10mL，配置浓度为50μg/mL的标准中间液，此中间液可在一18℃以下避光存放6个月.4.15标准工作液：将杆菌肽A中间液用0.1mol/L甲酸稀释至1μg/mL，现用现配.4.17周相萃取柱：亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡略烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物.4.18 BEH C18:1.7 μm 50 mmX2.1 mm 4.19滤膜；0.22μm
4.16基质标准工作液.
5仪器
5.1液相色谱-串联质谱仅液相色谱：配有电喷雾离子源（ESI）.5.2高速冷冻离心机. 5.3高速组织搞碎机.5.4氮气浓缩装置.5.5快速混勾器.5.6移液器：0.1mL 0.2mL.1.0mL.5.0mL.5.7均质器. 5.8分析天平：感量为0.01g和0.01mg5.94.17局相萃取柱：60mg.5.10聚四氟乙烯离心管：50mL.5.11进样瓶：1.5mL.5.12基本型水平振荡器. 5.13超声波仪.5.14一次性注射式滤器：配有0.2μm微孔滤膜.
6分析步骤
6.1制备与保存
无菌采集静脉血10mL放于含有抗凝血剂的试管中，一18C以下长期保存.
6.1.2饲料样品制备和保存
从所取原始样品中取出部分有代表性样品，经高速组织搞碎机接碎，用四分法缩分出不少于500g试样，均分成两份，装入清洁容器内，加封后作出标记，一份作试样，一份作留样.样品于一18C保存.
6.2分析步骤
6.2.1提取
6.2.1.1血液
准确称取（1.0±0.01）g试样，置于50mL具塞塑料离心管中.加人5mLEDTA溶液和5mLTCA
溶液，振荡混匀，加人4%三氯乙酸乙晴溶液2mL.混匀，超声波超声5min，4000r/min离心10min，取上清液至另-50mL离心管中，样品残渣再加人10mL甲醇-0.1%甲酸水溶液（体积比2：5）提取液重复提取1次，合井上清液于50mL离心管，待用.
6.2.1.2饲料
准确称取（5.0±0.01)g试样，置于50mL具塞塑料离心管中，加人10mLEDTA溶液和10mLTCA溶液，振荡15min.4000r/min离心10min.取上清液至另一50mL离心管中，样品残渣再加人10mL甲醇-0.1%甲酸水溶液（体积比2：5）重复振荡提取1次，离心，合并上清液于50mL离心管， 待用.
6.2.2净化
预活化，上样，10mL水淋洗，5mL甲醇洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，40C下氮吹至干，用定容液 将待净化液体过固相萃取小柱（4.17）（60mg）固相萃取柱净化.固相萃取柱依次用3mL甲醇、水1mL复溶，混匀，过0.22μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定.
6.3仪器参数与测定
6.3.1液相色谱条件
液相色谱条件如下：
a）色谱杜：BEHCm，1.7μm.50mm×2.1mm，或相当者；b）柱温：30℃；c）流动相：A;0.1%甲酸，B，乙晴：梯度洗脱程序见表1；
表1梯度洗脱程序表
时间 0.1%甲酸 乙腊min % % 由线变化模式0 90 10 64 10 90 67 10 90 67.1 90 10 610 90 10 1
d）流速：0.2mL/min;e）进样量；15gl
6.3.2质谱条件
质谱条件如下：
b）扫描方式：止离子模式； a）离子源：电喷雾离子源；c）检测方式：选择反应监测（SRM）：d）喷雾电压：ESI（1）：4500V；c）鞘气压力：241.3kPa；f）辅助气压力：13.8kPa g）定性离子对、定量离子对和碰擅能量，见表2.
