中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4848.7-2017
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法 第7部分：荔枝和龙眼
Identification of mon honey plant species in export honey-Real-time PCRmethod-Part 7:Litchi and longan
前言
SN/T4848《出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法实时荧光PCR法》共分为8部分：
第1部分：荆条：第2部分：油菜： 第3部分：洋槐：第4部分：按树：第5部分：般树：第6部分：龙眼：第8部分：紫云英. 第7部分：荔枝和龙眼；
本部分为SN/T4848的第7部分.
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国安微出人境检验检疫局.
本部分主要起草人：陈颖、吴亚君、杨艳歌、刘鸣畅、李想、王斌、韩建助、邓婷婷、张九凯、宗凯.
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法 第7部分：荔枝和龙眼
1范围
SN/T4848的本部分规定了出口蜂蜜中荔枝、龙眼成分的实时荧光PCR检测方法.
本部分适用于出口蜂蜜中荔枝、龙眼或分的定性检测，本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为
0.1%（质量百分比）.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本 包括的 数单）适用于本文件.
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
蜂蜜honey
荔枝litchi
龙眼longan
龙眼（DimocarpuslonganLour.），又名圆眼、桂圆、羊眼果树，无患子科、龙眼属植物.
3.4
实时荧光PCRreal timePCR
在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始模板的定量及定性分析.
3.5
Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chainreaction）dNTP：脱氧核苷酸三确酸（deoxyribonuleoside triphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）UNG：尿啶N-糖基化酶（uracilN-glyeosylase）Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethyl）aminomethane] CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammoniumbromide）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid)Taq：水生栖热菌（Thermus aqaaticus）OD：光度密度（opticaldensity）TAMRA：段基四甲基罗丹明（Carboxy-tetramethyl-rhoda mine） FAM：股基荧光素（Carboxyfluorescein）BHQ1：黑洞猝灭基圈 1(Black hole quencher 1)
5方法提要
提取样品DNA，以荔枝或龙眼源性DNA为阳性对照，以其他蜜源植物DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照，使用特异性引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象判定是否存在荔枝或龙眼成分，
6试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.实验用水符合GB/T6682的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.
6.1检测用引物和探针：荔枝和龙眼成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针 详见表1.荔枝和龙眼引物扩增的靶标序列参见附录A.
表1荔枝和龙眼基因引物探针序列
物种名称 引物/探针序列（5'→3’） 扩增片段 靶基因长度F;GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA NADH dehydrogenase内参照 R;AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA 138 bp subunit B( mdh B )geneP;FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1R;CGTCGCCGACTGGAAAGATA F TCATGTGTGGTCTCAACCCG 90 bp msturase K(merK)荔枝和龙眼 P;FAM-TTACACAAAGATTCTATCAACTTTCTGGGC-TAMRA gene
6.2三氯甲烷（氯仿）
6.3异丙醇.
6.4体积分数为70%的乙醇.6.5NaCl 溶液（1.2mol/L).6.7 CTAB 提取缓液;20 g/L CTAB 1.4 mol/L NaC1 0.1 mol/L Tris-HC1 0.02 mol/L NaEDTA 6.6蛋白酯K（20mg/mL).pH 8.0.6.8CTAB 沉淀液：5g/1. CTAB，40mmol/L NaCl.6.910×PCR 级冲液;200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4) 200 mmol/L KCI.15 mmol/L MgCl6.10实时荧光PCR反应混合液：12.5pL反应体系包括：1U~2U（Unit.酶学单位）的Tag酶、1×PCR buffer、2.5 mmol/L~4 0 mmol/L 的 Mg²* 、0.2 U~1 U 的 UNG 、0.2 mmol/L 的 d(A C G) TPs、0.2mmol/L~0.4mmol/L dUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪无需ROX校正）.
7仪器设备
7.1实时荧光PCR仪. 7.2核酸蛋白分析仅或紫外分光光度计.7.3恒温水浴锅.7.5微量移液器;0.5μL~10pL 10μl~100pL，20μL~200pL.200μL~1 000μL7.6恒温混匀仪. 7.7涡旅震荡器.7.8pH计.7.9量筒：容量50ml7.10烘箱.
7.4离心机：离心力≥12000g.
8检测步骤
8.1DNA提取
8.1.1蜂蜜沉淀DNA提取
8.1.1.1蜂蜜样品50C水浴20min至充分融化，上下颠倒混匀.8.1.1.2取20mL蜂蜜样品，分成2管，每管10mL于50mL离心管中，加人无菌双蒸水至30mL，涡旋混匀，4000r/min离心10min，吸出上清（4C贮存备用）.8.1.1.3沉淀部分用1mL无菌水洗脱，分装于2mL离心管中，12000r/min离心5min，去除上清.12 000r/min离心10 min.8.1.1.5转移上层清液至2mL离心管中；加人0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12 000r/min离心10min 8.1.1.6加入等体积CTAB沉淀液混匀，13000r/min离心10min 8.1.1.7弃上清，加人350μL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀.8.1.1.8加人0.8倍体积的异丙醇混匀，-20C放置0.5h~1h.12000r/min转速4C离心10min~15 min.8.1.1.9弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000r/min转速下4C离心10min.
8.1.1.10弃上清，室温下晾干.加人50yL～100μL双蒸水，溶解沉淀，一20C保存.
