中华人民共和国国家标准
GB/T18646-2018代替GB/T 18646-2002
动物布鲁氏菌病诊断技术
Diagnostic techniques for animal brucellosis
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准代替GB/T18646-2002《动物布鲁氏菌病诊断技术》.本标准与GB/T18646-2002相比，主要技术变化如下：
增加了缩略语（见第3章）； 增加了规范性引用文件（见第2章）；增加了临床诊断方法，包括流行特点、临床症状和病理变化（见4.1、4.2和4.3）；增加了试管凝集试验中的微量法（见4.6.1）：增加了补体结合试验中的微量法，并规定了其稀释液的制备、溶血素效价的测定、补体效价的 测定、溶血标准比色的制备方法（见4.7.1、附录B、附录C、附录D和附录E）：一增加了间接酶联免疫吸附试验，并规定了酶联免疫吸附试验抗原包被板的制备、酶标抗体的制备、酶联免疫吸附试验用试剂的配制（见4.8、附录G、附录H和附录1)；一增加了竞争酶联免疫吸附试验，并规定了酶联免疫吸附试验抗原包被板的制备、酶标抗体的制一增加了病原的涂片染色镜检（见4.10）； 备、酶联免疫吸附试验用试剂的配制（见4.9、附录G、附录H和附录1）；一增加了病原的分离培养，规范了培养细菌所用的培养基及病料采集需采集的样本名称（见4.11、附录J和附录K）；一增加了病原的生化特性鉴定方法，并规定了不同生化试验的培养基制备（见4.12.1~4.12.5、附增加了病原的因子血清试验鉴定方法，以表格形式列出单因子血清试验结果（见4.12.6和 录L和附录M);表4)；一增加了病原的噬菌体溶解试验鉴定方法，以表格形式列出各菌种噬菌体溶解试验结果（见4.12.7一增加了布鲁氏菌种的PCR扩增图谐鉴定技术，并规范了其8对引物序列，以图谱形式列出布 和表5）；鲁氏菌种10个种的扩增条带和3个疫苗株的扩增条带（见4.13、附录N和图1）；一增加了警告内容，对于剖检、采样及实验室开展相关病原活动部分及实验室接触有毒物质部分给以警告.
本标准由中华人民共和国农业部提出.
本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口.
本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心（辽宁省动物医学研究院）、中国动物卫生与流行病学中心、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所.
本标准主要起草人：李璐、赵晓彤、曹东、范伟兴、段亚良、田莉莉、步志高、顾贵波、杨作丰、赵风菊、
谷志大、秋栋栋、闫明媚、张慧、魏浏、郑洪玲、张喜悦、胡森.
引言
布鲁氏菌病（简称布病）是由布鲁氏菌属细菌感染导致人兽共患的传染病在全世界范围内严重威人类健康并影响畜牧业发展，布鲁氏菌属包括羊种布鲁氏菌（B.aelitensis）、牛种布鲁氏菌（B.abor-s）、猪种布鲁氏菌（B.suis）、绵羊附翠种布鲁氏菌（B.ois）、犬种布鲁氏菌（B.canis）、沙林鼠种布鲁氏菌（B.neotomae）、鲸种布鲁氏菌（B.certi）、鳍种布鲁氏菌（B.pinnipedialis）和田鼠种布鲁氏菌 （B.microri）及新报道的B.inopinata，其中动物布病主要是由羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌和猪种布鲁民菌感染羊、牛和猪等动物呈急性或慢性经过，是人布病的主要传染来源.其临床主要特征是生殖器官和胎膜发炎，母畜流产、乳腺炎、不育和各种组织（如睾丸、关节）的炎症.世界动物卫生组织[WorldOrganization for Animal Health（英），Ofice Intentional des Epizootic（法），OIE将布病列为法定报告 的传染病，我国（一、二、三类动物疫病病种名录》规定布病为多种动物共患的二类动物疫病.
本标准参考了OIE（陆生动物诊断试验和疫苗手册》，转化了其相关的布病诊断方法并引人到本标准中.本标准修订了原有血清学诊断方法，引人了ELISA诊断方法建立了我国微量凝集反应，补充了病原学和分子生物学诊断方法，不仅适用于我国布鲁氏菌病诊断需求，也达到了国际诊断水平.
动物布鲁氏菌病诊断技术
1范围
本标准规定了动物布鲁氏菌病的临床诊断、血清学和病原学诊断的技术方法、操作程序和判定标准.
本标准规定的流行特点、临床症状、病理变化适用于动物布鲁氏菌病的临床诊断.
虎红平板凝集试验和间接酶联免疫吸附试验，适用于动物布鲁氏菌病的初筛试验；
乳牛全乳环状试验，适用于泌乳母牛布鲁氏菌病的初筛试验；
试管凝集试验、补体结合试验和竞争酶联免疫吸附试验适用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌病的血清学确诊；
病原的显微镜检查、分离培养适用于布鲁氏菌病的病原学初步诊断：病原的鉴定和PCR试验适用于动物布鲁氏菌病的病原学确诊.
本标准规定的乳牛全乳环状试验，不适用于检测患乳房炎及其他乳房疾病母牛的乳、初乳、脱脂乳和煮沸过的乳，也不适用于腐败、变酸和冻结过的乳.
氏菌的检测， 本标准规定的虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验，不适用于犬种和绵羊附睾种布鲁
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T18088出人境动物检疫采样
GB19489-2008实验室生物安全通用要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件.
RBT虎红平板凝集试验（Rose Bengal Test)MRT乳牛全乳环状试验（MilkRingTest）SAT试管集试验（Serum Agglutination Test)iELISA间接酶联免疫吸附试验（Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay) CFT补体结合试验（Complement Fixation Test）cELISA竞争酶联免疫吸附试验（Competitive Enzyme Linked Immunosorbent Assay）PCR聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）DNA脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）dNTPs脱氧核苷三磷酸（Deoxy-RibonucleosideTriphosphate)TBE三羟甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸缓冲液（TrisBoricAcid EDTA）
OIE世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health(英) Office Intentional des Epi-zootic(法))
GB/T 18646-2018
HRP辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase）
4诊断方法
4.1流行特点
的易感性随着性成熟年龄接近而增高，在母畜中，第一次妊娠母畜发病较多. 多种动物对布鲁氏菌易感，羊、牛、猪的易感性最强.母畜比公畜易感，成年畜比幼年畜易感.动物
患病和带菌动物是主要传染源，尤其是感染的妊娠母畜，在流产或分娩时将大量的布鲁氏菌随着胎儿、胎水和胎衣排出，流产后的阴道分泌物和乳汁中都含有布鲁氏菌.
布鲁氏菌病的传播途径主要是消化道，也可通过皮肤、黏膜、交配等感染，蜱的叮咬可传播本病.
布鲁氏菌病呈现明显的接触传播特征，通过直接接触或间接接触均可造成传播，在牧区或农牧区多发，疾病的发生不具有明显的季节性，在有感染的群体内呈扩散传插特点.一般为散发，羊种布鲁氏菌病可呈地方流行性发生.
4.2临床症状
潜伏期一般为14d~180d.
显著症状是妊娠母畜发生流产，流产后可能发生胎衣滞留和子宫内膜炎从阴道流出污移不洁、恶臭的分泌物.新发病的畜群流产较多：老疫区畜群发生流产的较少，但发生子宫内膜炎、乳房炎、关节炎、局部脓肿、胎衣滞留、久配不孕的较多、公畜往往发生睾丸炎、附睾炎或关节炎.
4.3病理变化
警示一一对本病剖检采样过程当中应当防止病原微生物扩散和感染.
主要病变为妊娠或流产母畜子宫内膜和胎衣的炎性浸润、渗出、出血及坏死，有的可见关节炎，胎儿主要呈败血症病变，浆膜和黏膜有出血点和出血斑，皮下结缔组织发生浆液性、出血性炎症.
组织学检查可见脾、淋巴结、肝、肾等器官形成特征性肉芽肿.
4.4虎红平板凝集试验（RBT）
4.4.1器材
微量移液器，灭菌移液器吸头、牙签或混匀棒，计时器，洁净的玻璃板（其上划分成4cm²的方格）.
4.4.2试剂
商品化的布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原、布鲁氏菌标准阳性血清和布鲁氏菌标准阴性血清.
4.4.3操作方法
4.4.3.1按常规方法采集和分离受检血清.4.4.3.2将受检血清、布鲁氏菌标准阴、阳性血清和抗原从冰箱取出平衡至室温.4.4.3.3涡旋混匀血清和抗原，分别吸取25pL的血清和抗原加于玻璃板4cm²方格内的两侧.4.4.3.4用灭菌牙签或混匀棒快速混匀血清和抗原，涂成2cm直径的圆形，混匀后4min，在自然光下 观察.4.4.3.5试验应设标准阴、阳性血清对照.
4.4.4结果判定
4.4.4.1在标准阴性血清不出现减集、标准阳性血清出现凝集时，试验成立，方可对受检血清进行判定.
