中华人民共和国国家标准
GB/T20395-2006
Identification of the pathogen of pebrine for silkworm(Bombyxmoril.）
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
桑蚕微粒子病是我国进境动物检疫危险性病害，为防止该病随桑蚕茧进境而传入我国，在进境动物检疫时需正确掌握桑蚕微粒子病原孢子的检疫和鉴定方法.
本标准在制定过程中，总结了多年桑蚕茧检疫的实践经验，根据桑蚕微粒子孢子的形态学特征和遇酸溶解的化学特性，确定了检疫和鉴定桑蚕微粒子病原孢子的各项技术要求.
本标准的附录A是规范性附录.
本标准由国家标准化管理委员会提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：吴希君、边玉民、李广华、王宝忠.
本标准是首次发布的国家标准.
桑蚕微粒子病病原鉴定方法
1范围
本标准规定了桑蚕中微粒子病原孢子的检疫和鉴定方法.本标准适用于桑蚕茧中感染微粒子病的检疫和鉴定.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB6682-1992分析实验室用水规格和试验方法
GB/T18088-2000出人境动物检疫采样
3原理
微粒子病的病原体微孢子虫是一种原生动物，分类地位属于原生动物门，单丝孢子虫亚门，微孢子虫纲，微孢子虫目，单丝孢子虫亚目，微孢子虫科，微孢子虫属.它的生活周期中有孢子、孢子发芽、裂殖体、孢子形成期.
孢子呈卵形或长卵网形，大小为（3.6μm~3.8ym）×（2.0μm~2.3μm），单细胞结构，见附录A.其大小在一定范围内是相对稳定的，但由于寄主发育阶段及寄生部位不同而有差异，在显微镜下呈涉 蓝色，折光性强，密度1.30~1.35，遇酸溶解.孢子进入桑蚕消化道后，受消化液的作用而发芽，弹出极丝，放出孢原质，进一步形成裂殖体，裂殖体常以二分裂法增殖，进人孢子形成阶段形成孢子.孢子是微粒子原虫的休眠体.由孢子侵入蚕体至新孢子形成，一般需要4d～8d.
微粒子病的传染源包括患病的蚕、、蛾的尸体、排泄物（如：蚕粪、熟蚕尿、蛾尿）、脱离物（如：蜕皮壳、壳、鳞毛等）.其传插途径主要是食人传染和胚种传染.被微粒子孢子感染的病蚕上族结茧后，随 桑蚕茧进境而传播.在进境桑蚕茧检疫工作中，该病原孢子的形态特征、特性是本标准鉴定方法的依据.
4试剂
4.1浓盐酸（HCI) 4.220%的氢氧化钠（NaOH）.4.3分析用水按GB/T6682-1992规定执行.
5仪器、设备
5.1相差显微镜.5.2生化培养箱（温控范围10C~50C）.5.3冰箱.5.4天平（感量：0.1g）.5.5离心机. 5.6离心管.5.7载玻片.
GB/T 20395-2006
5.8盖玻片.5.10研体. 5.9量筒.5.11手术剪、镊子.5.12烧杯.5.13培养Ⅲ.5.15采样袋. 5.14移液管.5.16医用纱布.
6抽样方法
6.1抽查
6.1.1抽查方法
抽查在现场进行，抽查前应对待检桑蚕茧的有关单证、产地、包装、数量等进行核实，用随机的方法进行抽查.首先抽查蚕茧是否烘干，剪开蚕茧后，其内容物手捏成粉末状为烘干茧，而手捏发涩，甚至有液体流出者为半干茧，烘干茧内一切病源微生物都已被灭活，半干茧内感染的微粒子孢子未被灭活，具有传染性和致病性.
6.1.2抽查件数
按表1所列比例抽查.
表1取样、采样（GB/T18088-2000）
动物产品种类 批量货物总数/件 抽检货物的采样数/件 每份样品的量101~250 ≤100 7蚕茧 251~10 000 8 9 10粒蚕黄>10 000 （最多10)
6.2采样
6.2.1采样结合抽查进行，按表1所列比例采样.
6.2.2采样过程中应选取半干茧（包括农药杀蛹茧、日晒去湿茧）、鲜茧及蛾作为样品，带回实验室检验.
6.3样品的保存
0C~4C冰箱中保存，以备检验.保存样品装袋经密封后，置于一18C保存3个月.如发现桑蚕微粒子 现场采样后，将样品混匀后平均分成两份，一份作为检样，一份作为保存样品.检样装袋后置于病，该样品至少需保存6个月，以备复验、谈判和仲裁.
7显微镜检查
7.1直接检查法
从检样中取出，蛾剖开后，用镊子沾取体内不同部位少许组织分别涂于不同载玻片上，加人适量无菌水混匀，盖上盖玻片镜检（600倍以上）有无微粒子孢子.若检样中脂肪球数量过多影响镜检时，应加人适量20%氢氧化钠充分混匀作用10min后再进行检查，直接判定.如果镜检该批检样未检出微粒子病原孢子时，需收集检样用7.2法离心浓缩后再进一步检查.
7.2离心浓缩法
经7.1法未检出微粒子病原孢子的检样收集后，将蝇及其他残留组织、蛾于研钵中加2倍～3倍20%氢氧化钠溶液充分磨碎并作用10min后，加人适量无菌水充分搅拌，用两层医用纱布过滤除去残
渣，将滤液倒人离心管，以4000r/min离心10min~20min，弃去上清液，加适量无菌水于离心管充分搅拌沉淀物再离心弃去上清液，取沉淀物置载玻片上，加人适量无菌水混匀，盖上盖玻片镜检（600倍以上）有无微粒子孢子，每个检样至少检查10个玻片.
7.3酸溶解法
镜检时有时会遇到畸形的微粒子孢子（多半是梨形或长形孢子），往往易与真菌孢子相混淆，必要时可进行酸溶解处理，加以签别诊断.取检出样2滴，分别滴于载玻片两端，自然干燥后在其中一点加一滴浓盐酸（密度1.15），另一点作对照，在30C生化培养箱中放置10min~20min后，然后盖上盖玻片镜检（600倍以上）.如果试样已于，可加无菌水一滴.经过酸处理的检样，微粒子溶解消失，而真菌孢 子仍保持原状.
8结果判定
8.1直接检查法及离心浓缩法
当镜检发现孢子呈卵形或长卵圆形，大小为（3.6μm~3.8μm）×（2.0pm~2.3μm），呈淡蓝色，折光性强，判定其为微粒子孢子（见附录A）.
8.2酸溶解法
加酸作用后，被溶解的孢子判定其为微粒子孢子.
