中华人民共和国国家标准
GB/T 20758-2006
牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、 孕酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Method for the determination of testosterone epi-testosterone andprogesterone residues in bovine liver and muscle tissuesLC-MS-MSmethod
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局.本标准主要起草人：庞国芳、林峰、林海丹、张美金、黄华军.
本标准系首次发布的国家标准.
牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛肝和牛肉中率酮、表睾酮和孕酮残留量的液相色谱-申联质谱测定方法.
本标准适用于牛肝和牛肉中睾酮、表睾酮、孕酮残留量的测定.
孕酮为0.5μg/kg. 本标准的方法检出限：肝脏中睾酮、表率酮、孕酮为0.5μg/kg，肌肉中酮、表睾酮为0.1pg/kg，
2规范性引用文件
下列文件中条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1:1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992，neqISO3696：1987)
3原理
牛肝和牛肉中的睾酮、表睾酮、孕酮药物残留经酶解后用甲醇叔丁基甲醚提取，提取液用C固相萃取柱净化，肝脏样品需再经硅胶固相萃取柱净化，洗脱液浓缩定容后，供液相色谱-申联质谱测定.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1乙晴：色谱纯.4.2甲醇：色谱纯. 4.3叔丁基甲醚：色谱纯.4.4正已烷：色谱纯，4.5三氯甲烷4.7p-葡糖苷酸酶和硫酸酯酶：H-2型，helix pomatia. 4.6甲酸铵.4.8磷酸盐缓冲液：1.0mol/L.称取13.6g磷酸二氢钾溶于100mL水中，称取8.7g磷酸氢二钾溶于50mL水中，分别取70mL磷酸二氢钾水溶液和28mL磷酸氢二钾水溶液，混匀后调节pH值为5.0，置4C中可保存1周.4.10水饱和乙酸乙酯.4.11睾酮、表睾酮、孕酮标准物质：纯度≥99%：氛代睾酮（d-睾酮）、尔代孕酮（d-孕酮）内标标准物质：纯度≥98%.
4.9饱和氯化钠水溶液.
4.12标准储备溶液：100pg/mL.准确称取适量的攀酮、表睾酮、孕酮标准物质，用甲醇分别配制成100μg/mL的标准储备溶液，一18C贮存，可使用6个月.4.13标准工作溶液：5pg/mL.分别吸取5mL率酮、表睾酮、孕酮标准储备溶液（4.12）至100mL容 量瓶中，以甲醇稀释并定容，此标准工作溶液的浓度为5pg/mL.-18C贮存，可使用6个月.4.14混合标准工作溶液：50μg/1L.分别吸取1.00ml睾酮、表塞酮、孕酮标准工作液（4.13）至100mL容量瓶中，以甲醇稀释并定容，此混合工作溶液的浓度为50pg/L.-18C贮存，可使用3个月.4.15内标储备溶液：100μg/mL.准确称取适量的氛代睾酮（d-睾酮）、氰代孕酮（d-孕酮）标准品，用4.16内标工作溶液：5μg/mL.分别吸取5mL尔代案酮（d-睾酮）、氯代孕酮（d -孕酮）内标储备溶液 甲醇分别配制成100pg/mL的内标储备溶液，一18C贮存，可使用6个月.（4.15）至100mL容量瓶中，以甲醇稀释并定容.一18C贮存，可使用6个月.4.17内标混合工作溶液：25μg/L.分别吸取0.50mL尔代率酮（d-睾酮）、氛代孕酮（d-孕酮）内标工作溶液（4.16）至100mL容量瓶中，以甲醇稀释并定容.一18C贮存，可使用3个月.液（4.14）和内标工作溶液（4.16），用空白样品提取液配成系列浓度的基质混合标准工作溶液.当天配制.4.19C固相萃取柱：500mg.5mL.使用前依次用6mL甲醇、6mL水活化.4.21滤膜；0.2ym. 4.20硅胶固相萃取柱：200mg，6mL.使用前用6mL正已烷活化.
5仪器和设备
5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g. 5.1液相色谱-申联质谱仪，配有电喷雾离子源.5.3匀质机.5.4高速组织匀浆机.5.5低温高速离心机；转速大于4000r/min.5.6高速离心机：转速大于12000r/min.5.8旋涡振荡器. 5.7超声波.5.9振荡水浴.5.10氮气浓缩仪.5.11固相萃取装置. 5.12旋转蒸发器.5.13KD浓缩瓶.
6试样制备与保存
6.1试样的制备 取样品约500g用组织揭碎机捣碎，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记.6.2试样的保存将试样于-18C保存.
7测定步骤
准确称取5g试样，准确至0.01g，置于50mL离心管中，依次加人200pL内标混合工作溶液2
（4.17)、10 mL磷酸盐缓冲液（4.8），以 14 000r/min 均质 30 s 加人60L 葡萄糖苷酸酶和硫酸酯酶（4.7）.混匀30s，置于37C恒温振荡水浴中酶解16h.
7.2提取
酶解后的样品溶液（7.1)加10mL甲醇，混匀2min，置冰浴中放置5min，在5C以4 000r/min离心10min，上清液转移至50mL离心管中，下层沉淀再用5mL甲醇重复上述操作一次，合并上清液至上述50mL离心管中，向离心管中加人15mL权丁基甲醚，振摇5 min，以4000r/min离心5min，上层溶液转移至125mL分液漏斗中，下层溶液依次再用15mL、10mL叔丁基甲醚提取两次，合并上至梨形瓶中，在40C旋转蒸发至干，残渣中加人1.5mL甲醇，涡旋1min，超声5min，再加人20mL 层溶液至上述分液漏斗中，加入10mL饱和氯化钠水溶液（4.9），振摇30s，静置分层，上层溶液转移水，混匀，待净化.
7.3净化
将样品提取液（7.2）转移至已活化的C固相萃取柱（4.19）上，用5mL水洗涤梨形瓶，洗涤液合并至C固相萃取柱中，以≤2mL/min流速使样液通过固相萃取柱，待样液过柱后，用5mL.水淋洗C 固相萃取柱，弃去淋洗液，用10mL甲醇将待测组分从C固相萃取柱上洗脱，洗脱液转移至梨形瓶中，在40C旋转蒸发至干.肌肉样品用0.5mL甲醇溶解残渣，涡旋1min，加入0.5mL水混匀，过0.2pm滤膜，供液相色谱-申联质谱测定.
声1min，然后转移至已活化的硅胶固相萃取柱（4.20）中，以1mL/min流速使样液通过固相萃取柱， 肝脏样品的洗脱液蒸干后，向梨形瓶中加人0.5mL三氯甲烷，涡旋1min，加人5mL正已烷，超待样液过柱后，用5mL正已烷淋洗硅胶固相萃取柱，弃去淋洗液，用6mL水饱和乙酸乙酯（4.10）洗脱待测组分，洗脱液转移至KD接收瓶中，在40C旋转蒸发至干，加0.5mL甲醇，涡旋1min，加人0.5mL水混匀，过0.2μm滤膜，供液相色谱-申联质谱测定.
称取阴性样品，按7.1、7.2和7.3步骤制备空白样品提取液，用于配制系列基质混合标准工作溶液.
7.4测定
7.4.1液相色谱条件
a）色谱柱：C色谱柱，5pm，150mm×2.1mm（内径）： b）柱温：40C；c）进样量：20L;d）流动相、流速及梯度洗脱条件见表1.
表1流动相、流速及梯度洗脱条件
间/min 流速/(mL/min) 乙晴/(%) 3mmol/L甲酸铵/(%)0 00 0 200 30 7010 00 15 00 0 200 0 200 85 85 15 1515 01 0 200 30 7023 01 0 200 30 70
7.4.2质谱条件
a）离子源：电喷雾离子源：b）扫描方式：正离子扫描；c）检测方式：多反应监测： d）雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求：
