中华人民共和国国家标准
GB/T 22959-2008
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素、甲矾霉素 和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination of chloramphenicol thiamphenicol and florfenicol residues in fugu.eel and baked eelLC-MS-MS method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.
本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：林海丹、李宪华、谢守新、林峰、黄华军、邵琳智、庞国芳.
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素、甲矾霉素 和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素（chloramphenicol）、甲碱霉素（thiamphenicol）和氟苯尼考（florfenicol）及其代谢物氟苯尼考胺（florfenicolamine）残留量的液相色谱-中联质谱测定方法.
本标准适用于河豚鱼，鳗鱼和烤鳗中的氯霉素、甲霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量的测定.
本标准的方法检出限：河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素为0.1μg/kg，甲霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺为1. 0μg/kg-
2规范性引用文件
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.12004 ISO 5725-1;1994 IDT)
性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987.MOD）
3原理
样品中的氯霉素、甲霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在碱性条件下，用乙酸乙酯提取，提取液旋转蒸发挥干，残渣以水溶解，经正已烷液液分配脱脂.液相色谱-串联质谱仪检测，氯霉素、甲祺霉素和氟苯尼考以内标法峰面积定量，氟苯尼考胺以外标法峰面积定量.
4试剂
所用试剂除注明外均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2乙酸乙酯.4.3正已烷.4.4氨水：25%~28%. 4.5无水硫酸钠：使用前经650C灼烧4h.4.6标准物质：氯霉素（CAS;56-75-7)、甲霉素（CAS：15318-45-3）和氟苯尼考（CAS：76639-94-6），纯度≥99.5%；氟苯尼考胺，纯度≥98.0%4.7内标标准液：氟代氯霉素（d-氯霉素），100μg/mL，溶剂为乙睛，氟化度≥98%. 4.8100μg/mL标准储备液：分别准确称取适量的氯霉素、甲矾霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺标准物质（4.6），用甲醇分别配成100pg/ml的标准储备液.该溶液于-18C保存.4.91pμg/mL氯霉素、甲矾霉素和氟苯尼考混合标准储备液：分别准确吸取1.00mL氯霉素、甲祺霉
由/由0（8）氟苯尼考混合标准储备液，该溶液于一18C保存.4.1120ng/ml氯霉素、甲矾霉素和氟苯尼考混合标准中间液：准确吸取1.00mL混合标准储备液 量瓶中，用甲醇配成1ug/mL的氟苯尼考胺标准储备液.该溶液于-18C保存.（4.9），移至50mL容量瓶中.用水配成20ng/mL的氯霉素、甲霉素和氟苯尼考混合标准中间液，该溶液于4C保存.4.1220ng/mL氟苯尼考胺标准中间液：准确吸取1.00mlL氟苯尼考胺标准储备液（4.10），移至50mL4.131pg/mL内标标准储备液：准确吸取1.00pL内标标准液（4.7），移至10mL容量瓶中，用甲醇 容量瓶中，用水配成20ng/mL的氟苯尼考胺标准中间液.该溶液于4C保存.配成1μg/mL内标标准储备液，该溶渡于-18C保存.4.1420ng/ml内标标准中间液：准确吸取1.00mL内标标准储备液（4.13），移至50mL容量瓶中，用水配成20ng/mL的内标标准中间液.该溶液于4C保存.4.15氯霉素、甲矾霉素和氟苯尼考混合基质标准工作溶液：根据每种标准的灵敏度和仪器线性范围，临用时吸取一定量的混合标准中间液（4.11）和内标标准中间液（4.14），用空白基质溶液配成适当浓度 的混合基质标准工作液，每毫升该混合基质标准工作溶液含有0.15ng尔代氯霉素（d-氯霉素）.4.16氟苯尼考胺基质标准工作溶液：根据标准的灵敏度和仪器线性范围临用时吸取一定量的标准中间渡（4.12)，用空白基质溶液配成适当浓度的氟苯尼考胺基质标准工作液.4.17滤膜：0.2 yum.
5仪器
5.1液相色谱-中联质谱仪：配有电喷雾离子源，5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.3离心机：转速≥4000r/min5.4小型台式离心机：转速≥13000r/min5.5组织捣碎机.5.6匀浆机. 5.7减压旋转蒸发仪.5.8超声波水浴.5.9旋涡振荡器.5.10聚丙烯离心管：带盖，50mL，1.5mL.5.12具塞比色管：50ml. 5.11鸡心瓶：25mL.
6试样制备与保存
6.1试样的制备
从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分约500g，用组织揭辞机充分捣碎均匀，装人洁净容器，密封，并标明标记. 制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化.
6.2试样的保存
将试样于-18C冰箱中保存.
7测定步骤
7.1提取
称取5g试样，精确至0.01g，置于50mL聚丙烯离心管中，加人内标标准中间液（4.14）75.0pL，清液转移至50mL比色管中.另取一50mL离心管加人20ml乙酸乙酯，0.60mL氨水，洗涤匀浆刀头10s，洗涤液移人第一支离心管中，用玻棒搅动残渣，旋涡振荡提取1min，超声波振荡提取5min，4 000r/min离心5min，上清液合并至50mL比色管，乙酸乙酯定容至50.0mL，摇匀后移取10.0mL乙酸乙酯提取液于25mL鸡心瓶，45C减压旋转浓缩至干.
7.2净化
30s，静置分层，弃掉上层的正已烷，再加3mL正已烷旋涡振荡混合30s，静置分层，移取部分下层的水相于1.5mL的聚丙烯离心管中，13000r/min离心5min，经0.2μm滤膜过滤后，供液相色谱-串联质谱测定氯霉素、甲矾霉素和氟苯尼考.另吸取100uL滤液于液相进样瓶，加入400gL水，混匀，供液相色谱-串联质谱测定氟苯尼考胺.
7.3空白基质溶液的制备
称取5g空白样品，精确至0.01g，除不加人内标标准中间液，其他按7.1和7.2步骤操作.
7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
7.4.1.1氯霉素、甲矾霉素和氟苯尼考测定
a)色谱柱：SUPELCO Discovery C5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；b）柱温：40C； c）流动相：甲醇-水（23）；d）流速：0.30 mL/min;e）进样量：20p.
7.4.1.2氟苯尼考胺测定
a）色谱柱：IntersilC-3，5ym.150mm×4.6mm（内径）或相当者；c）流动相：甲醇-水（41）： b）柱温：40C；d）流速：0.30 mL/min;e）进样量：10pl.
7.4.2质谱参考条件
a）离子源：电喷雾离子源（ESI）；b）扫描方式：负离子扫描（氯霉素、甲矾霉素和氮苯尼考测定），正离子扫描（氟苯尼考胺测定）： c）检测方式：多反应选择离子检测（MRM）：d）电喷雾电压（IS）：-4200V（氯霉素、甲祺霉素和氟苯尼考测定），4500V（氟苯尼考胺测定）；e）雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求：f）输助气温度（TEM）：600C；g）定性离子对、定量离子对、采集时间、去簇电压及碰撞能量见表1.
