中华人民共和国国家标准
GB/T23408-2009
Determination of macrolides residues in honeyLC-MS/MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录.本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局.本标准主要起草人：吴斌、徐锦忠、陈惠兰、刘艳、黄娟、魏云计、蒋原、陶宏锦.
蜂蜜中大环内酯类药物残留量测定 液相色谱-质谱/质谱法
1范围
本标准规定了蜂蜜中大环内酯类药物残留量液相色谱-质谱/质谱测定方法.
本标准适用于蜂蜜中罗红霉素、替米考星、泰乐菌素、北里霉素、交沙霉素、竹桃霉素、螺旋霉素-1、红霉素残留量的测定.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987 MOD)
3方法提要
试样用碱性溶液提取，经固相萃取柱净化，洗脱液浓缩定容后，用液相色谱-质谱/质谱仪测定，外标法定量.
4试剂和材料
除非另有说明，试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2碳酸钠. 4.3碳酸氢钠.4.4甲醇-水（28，体积比）：量取20mL甲醇（4.1）与80mL水混合.4.5甲醇-水（46，体积比）：量取40mL甲醇（4.1）与60mL水混合.4.6替米考星（Tilmicosin CAS号：108050-54-0）、螺旋霉素-I（Spiramycin-I，CAS号：8025-81-8）、竹桃霉素（Oleandomycin CAS号：7060-74-4）、红霉素（Erythromycin，CAS号：114-07-8）、罗红霉素 Roxithromycin，CAS号：80214-83-1）、泰乐菌素（Tylosin，CAS号：1405-54-5）、北里霉素（Kitasamycin，CAS号：8059-95-8）和交沙霉素（Josamycin，CAS号：16846-24-5）标准物：纯度>92%.4.7大环内酯类药物标准储备溶液：1.0mg/mL.准确称取（精确至0.1mg）适量的大环内酯类药物标准物质（4.6）.用甲醇（4.1）配成1.0mg/mL的标准储备液.储备液贮存在4C冰箱中，可使4.8空白样品提取液：用不含药物残留的样品，按照7.1制备空白样品溶液. 用2个月.4.9大环内酯类药物标准工作溶液：用空白样品提取液分别配成大环内酯类药物浓度为5ng/ml、10ng/mL20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的标准工作溶液，现用现配.4.100.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠（pH9.3）缓冲溶液：称取5.3g碳酸钠（4.2）和4.2g碳酸氢钠（4.3）溶于800mL水中，用稀氢氧化钠或稀盐酸调节pH为9.3，加水稀释至1000mL. 4.11聚苯乙烯吡略烷酮填料固相萃取柱或相当者：60mg，3mL.使用前分别用3mL甲醇和5mL水预处理保持柱体湿润.
4.12滤膜；0.45pm，水相.
5仪器
5.2分析天平：感量分别为0.1mg和0.01g. 5.1液相色谱-质谱仪（中联四极杆）：配有电喷雾离子源.5.3自动浓缩仪或相当者.5.4液体混匀器.5.5真空泵：真空度大于或等于80kPa.5.7刻度离心管：10ml. 5.6离心管：50mL，具塞，
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
对无结品的实验室样品，将其搅拌均匀.对有结品的样品，在密闭情况下，置于不超过60C的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温，分出0.5kg作为试样，制备好的试样置于样品瓶 中，密封，并标明标记，在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化.
6.2试样的保存
将试样于常温状态下保存.
7测定步额
7.1提取
称取5g试样（精确到0.01g）.置于50mL具塞离心管中，加人15mL0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液（4.10），于液体混匀器上快速混合1min，使试样完全溶解.将溶液以1mL/min左右的流速通过固相萃取柱（4.11），待溶液完全流出后，用5mL水洗离心管并过柱，然后再用5mL甲醇-水（4.4）洗柱，弃去全部淋出液.在65kPa的负压下，减压抽干10min，最后用5mL甲醇（4.1）洗脱，收集洗脱液于10mL刻度离心管（5.7）中，于50C用氨气吹干仪吹干，用甲醇-水（4.5）定容至1.0mL，过0.45um的滤膜（4.12）到进样瓶中，供液相色谱-质谱仪测定，
7.2测定
7.2.1液相色谱条件
a）色谱柱：C，5pm，150mmX2.1mm（内径）或相当者；b）流动相：0.1%甲酸甲醇，梯度参见附录A；c）流速：0.25mL/min; d）柱温：室温；e）进样量：25p
7.2.2质谱条件
串联四级杆质谱条件参见附录B.
7.2.3液相色谱-质谱测定
标，工作溶液浓度（ng/mL）为横坐标，绘制6点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶 大环内酯类药物标准工作溶液（4.9）在液相色谱-质谱设定条件下分别进样，以样品峰面积为纵坐液中大环内酯类药物的响应值均应在仪器测定的线性范围内.在上述色谱条件下，大环内酯类药物参考保留时间如表1所示.大环内酯类药物标准物质色谱图参见附录C.
表1八种大环内酯类药物参考保留时间
药物名称 保留时间/min螺旋街素-1 7 23皆米考星 8 24竹桃带素 8 53泰乐菌素 9 09北里霉素 9 36红霉素 9 55交沙霉素 10 13罗红霉素 10 52
7.2.4定性测定
进行样品测定时，如果检出的质量色谱峰保留时间与标准样品一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，最大允许相对偏差不超过表2中规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物.
表2定性确证时相对离子丰度的最大允许相对偏差
相对离子丰度 >50% >20% ~50% >10% ~ 20% ≤10%允许的相对佩差 ±20% ±25% ±30% ±50%
7.3平行试验
按以上（7.1~7.2）步骤，对同一试样进行平行试验测定.
7.4空白试验
除不称取试样外，均按上述（7.1~7.2）步骤进行.
8结果计算
结果按式(1)计算：
（1
式中：
X试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）：（一-由标准曲线面得的样液中药物的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）：c-由标准曲线面得的空白试验中药物的含量.单位为纳克每毫升（ng/mL)；--样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g）. 样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）；
9测定低限和回收率
9.1测定低限
旋霉素-I为0.5μg/kg，红霉素为0.1μg/kg. 本标准测定低限：罗红霉素、替米考星、泰乐菌素、北里霉素、交沙霉素为0.2ug/kg，竹桃霉素、螺
9.2回收率
大环内酯类药物回收率数据见表3.
