中华人民共和国国家标准
GB/T23881-2009
饲用纤维素酶活性的测定 滤纸法
Determination of feed cellulase activityFilter paper assay method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口，本标准起草单位：国家饲料质量监督检验中心（武汉）. 本标准主要起草人：何风琴、杨林、钱肪、刘小缴、屈利文、黄婷、颜克亮.
饲用纤维素酶活性的测定 滤纸法
1范围
本标准规定了以滤纸为底物，用还原糖比色法测定饲用纤维素酶活性的方法.本标准适用于饲用纤维素酶活性的测定，定量检测限为0.02U/mL.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
3. 1
滤纸纤维素酶活性单位filter Paper cellulase activity unit
在37C，pH5.5，反应60min的条件下，每分钟降解滤纸释放1pmol葡萄糖所需的酵量，定义为一个滤纸纤维素酶活性单位，以U表示.
4原理
纤维素酶水解滤纸产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大吸收，在一定范围内酶解产生的还原糖的量与反应液的吸光值成正比.
5试剂和材料
本标准使用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水.
5.1酒石酸钾钠（CHKNaO4H:O）5.2苯酚.5.3亚硫酸钠. 5.4氢氧化钠溶液（200g/L）：称取氢氧化钠20.0g，加100mL水溶解.5.5柠檬酸溶液（0.1mol/L）：称取柠檬酸（CHO;HO）2.10g，加水溶解定容至100mL5.6柠檬酸钠溶液（0.1mol/L）：称取柠檬酸钠（NaCHO2HO）2.94g，加水溶解定容至100 mL.5.7柠檬酸盐缓冲液（0.05mol/L，pH5.5）：称取柠檬酸（CHO：HO）10.5g，加人氢氧化钠5.0g， 再加800mL水溶解，用柠檬酸溶液（5.5）或柠檬酸钠溶液（5.6）调节pH至5.5.再用水定容至
1 000 mL
5. 8Whatman 1号滤纸条（1. 0 cm×6. 0cm）
5.9DNS试剂：称取3，5-二硝基水杨酸3.15g.加水500mL搅拌溶解，水浴至45C，然后逐步加人氢（5.2）2.50g和亚硫酸钠（5.3）2.50g，搅拌至溶解，冷却到室温后，定容至1000ml.过滤，取滤液贮 氧化钠溶液（5.4）100mL，同时不断搅拌，直至完全溶解，再逐步加人酒石酸钾钠（5.1）91.0g、苯酚存于棕色瓶中，避光保存，室温下存放7d后可以使用，有效期为6个月.
警告：处理酸碱和配制DNS试剂时，应在通风橱或通风良好的房间进行，戴上保护眼镜和乳胶手套，一旦皮肤或眼睛接触了上述物质，及时用大量的水冲洗.
5.10葡萄糖标准溶液（10.0mg/mL）：称取经105C烘至恒量的无水葡萄糖约1g，精确至0.0001g， 加柠檬酸盐缓冲溶液（5.7）溶解，定容至100mL.
6仪器与设备
除常用实验室设备外，其他仪器设备如下.6.2分析天平：感量为0.0001g. 6.1分样筛：孔径为0.25mm（60目）.6.3pH计：精确至0.01.6.4磁力搅拌器：附加热功能.6.5电磁振荡器. 6.6离心机.6.7恒温水浴锅.6.8秒表.6.9分光光度计.6.10移液器：精度为1l.
7试样的制备
按GB/T14699.1采样，按GB/T20195选取样品至少500g.四分法缩减至100g磨碎，通过0.25mm孔筛，混匀密闭容器中，低温保存.
8测定
8.1试样溶液的准备
称取0.2g~4g试样，精确至0.0001g，加人40mL柠檬酸盐缓冲液（5.7）.磁力搅拌30min.再3 000r/min离心3min.取5.00ml上清液，用柠檬酸盐缓冲液（5.7）做二次稀释（稀释后的待测酶液 用柠檬酸盐缓冲液（5.7）定容至100mL.在4C条件下避光保存24h.摇匀，取30mL~50mL，以中纤维素酶活性应控制在0.04U/mL~0.18U/mL之间）.
液体样品可以直接用柠檬酸盐缓冲液（5.7）进行稀释，定容（稀释后的酵液中纤维素酶活性应控制在0.04U/mL~0.18U/mL之间）.如果稀释后的酶液pH偏离5.5，需重新调节pH为5.5，用柠檬酸盐缓冲液（5.7）稀释定容.
8.2标准曲线
8.2.1分别量取葡萄糖标准溶液（5.10)0.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00ml、10.00mL，分别用柠檬酸盐缓冲溶液（5.7）定容至50mL 配成浓度为0.00mg/mL~2.00mg/mL的葡萄糖标准系列，
8.2.2分别吸取葡萄糖标准溶液（8.2.1）各1.00mL于25mL容量瓶中，各加2.00mL水和2.00mL DNS试剂（5.9），沸水浴5min.冷却至室温，用水定容至25mL，在540nm波长下比色，以吸光度作横坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为纵坐标，列出直线回归方程.
8.3酵活性的测定
8.3.1吸取10.0mL经过适当稀释的酶液（8.1）.37C平衡10min.
8.3.2在25mL具塞比色管中加入滤纸条（5.8）--滤纸条须对称剪成32片并全部放人，加1.0mL 柠橡酸盐缓冲液（5.7）浸润滤纸片，37C水浴平衡10min，再依次加人2.00mLDNS试剂（5.9），0.50mL酶液（8.3.1），5ml水，电磁振荡3s~5s，37C水浴中保温60min（用秒表控制），然后在沸水浴中煮沸5min，冷却至室温，用水定容至25mL.在540nm波长处测定校准值A.
8.3.3在25mL具塞比色管中加入滤纸条（5.8）--滤纸条对称剪成32片并全部放人，加1.0mL电磁振荡3s~5s，37C水浴中保温60min（用秒表控制），加2.00mLDNS试剂（5.9）.然后在沸水浴 柠檬酸盐缓冲液（5.7）浸润滤纸片.37C水浴平衡10min，再依次加人0.50mL酶液（8.3.1），5mL水，中煮沸5min，冷却至室温，用水定容至25mL.在540nm波长处测定吸光度A.
9结果计算
9.1试样中滤纸纤维素酶活性以X表示，单位为酶活性单位每克（U/g）.按式（1)计算：
式（1)中：
X试样纤维素酶的活性，单位为酵活性单位每克（U/g）：m--根据标准曲线方程上计算得的（A-A>值对应的葡萄糖的质量，单位为毫克（mg）；M---葡萄糖的摩尔质量.180.2g/mol；-酵解反应时间，单位为分钟（min）；1 000-转化因子，1mmol=1000mol; "试样的总稀释倍数.
9.2每个试样取两份试料进行平行试验，测定结果用其算术平均值表示，保留3位有效数字.
10重复性
在重复性条件下的两次测定，所得结果的相对偏差不超过20%.
