中华人民共和国国家标准
GB/T28089-2011
Detection and identification of Urocystis cepulae Frost
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国湖北出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：邵秀玲、赵汗青、王英超、种焱、吴兴海、张治宇、江丽辉、高文娜、张京萱、宋涛、罗志萍.
葱类黑粉病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了葱类黑粉病菌检疫鉴定方法.
本标准适用于洋葱等葱属中葱类黑粉病菌的检疫和鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T18085植物检疫小麦矮化屋黑穗病菌检疫鉴定方法 SN/T1157进出境植物苗木检疫规程SN/T1809进出口植物种子检疫规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
孢子球spore balls
由一至多数冬孢子集结面成，易分开成单独的冬孢子或坚固而不易分离，外层有浅色的较小的不孕细胞包围.
4葱类黑粉病菌基本信息
中文名：葱类黑粉病菌.
学名：Urocystis cepulαe Frost 1877
异名： Tuburciniα cepulae (Frost) Liro 1922 Tuburcinia magica (Pass. ) Liro 1922 Urocyxtiscolchici var. cepulae Cooke 1877 Urocystis magica Pass. 1875.
病害英文名：onion smut.
属真菌界Fungi，担子菌亚门 Basidiomycotina，黑粉菌纲Ustilaginomycetes条黑粉菌目Urocys-tales.条黑粉菌科Urocystaceae，条黑粉菌属Urocystis.
葱类黑粉病菌的其他信息参见附录A.
5方法原理
经现场查验，实验室分离培养，根据病原菌的形态特征、生物学特性，结合寄主范围进行结果判定.
6位器和用具
6.1生物显微镜（具油镜镜头，具测量功能）、具透射光源的体视显微镜（放大倍数不低于50×）.
6.2超净工作台.6.4光照恒温培养箱. 6.3电子天平.6.5酒精灯.6.6高压灭菌器.6.7培养Ⅲ.6.8医用手术剪、摄子.6.9烧杯（500mL）. 6.10试管（直径12mm）.6.11载玻片、盖玻片.6.12量简（500mL）.6.14刻度离心管；10mL或20mL， 6.13微量可调加样器（5μL~20μL).6.15加样器枪头（2uL~20gl).6.16三角瓶（250mL）.6.17席尔氏浮载剂（见GB/T18085）.6.18干热灭菌器. 6.19往复式振荡器.6.20涡族振荡器.
7主要试剂
7.1蒸馏水.7.2吐温-207.31%的次氯酸钠溶液.7.4洋葱琼脂培养基.
8现场检测
8.1抽样方法棋盘式、五点式或随机抽样.
8.2抽样数量
对来自葱类黑粉病菌发生国家和地区（参见附录A）的洋葱等种子按SN/T1809进行抽样.
8.2.2洋葱、大蒜等鳞茎
对洋葱、大蒜等鳞茎按SN/T1157进行抽样.
8.3症状检查
对洋葱、大蒜等鳞茎，注意检查鳞茎上是否有典型的黑粉症状，挑选个头小（孢子在鳞茎上产生可能引起鳞茎变小）、干腐的鳞茎，洋葱鳞茎常形成铅色到黑色的条斑；洋葱叶片上形成铅色到黑色的轻微变2
GB/T 28089-2011
厚的条斑或水泡，当增厚区域较大时可引起子叶向下弯曲.随着叶片基部病斑的扩大，病斑破裂漏出大量的黑色粉末.受侵染的植株通常变得矮小.
收集上述可疑植物材料等一并带回实验室检验.
9实验室检测
9.1鳞茎和寄主残体上病菌的鉴定
选取具有黑粉症状的可疑病斑，用针刺破囊肿，用席尔氏浮载剂制成玻片，在显微镜下观察孢子球的形态特征，
9.2种子上病菌的鉴定
9.2.1制备平均样品
在实验室内将送检样品充分混匀，制成平均样品.
9.2.2称样
从平均样品中称取50g作为实验样品.
9.2.3洗涤离心
实验样品倒人经干热灭菌（165C，1.5h）后的250mL三角瓶内，加蒸馏水100mL，再加表面活性剂吐温-20（1滴~2滴），用铝铂纸或parafilm膜将三角瓶封口，将三角瓶放在复式振荡器上振荡 5min，立即取下三角瓶，将悬浮液注人干热灭菌的10mL~20mL刻度离心管内离心（1000r/min）3min，取出离心管，顿去上清液，再加剩余悬浮液，重复离心，直至悬浮液离心完毕，留沉淀物.
9.2.4制片与镜检
至载玻片上，加盖玻片.制片用冬孢子悬浮液的体积以加盖玻片后悬浮液不外溢为宜，每份试验样品 离心管中，加人适量席尔氏浮载剂使之悬浮.用可调微量加样器吸取5uL~20pL冬孢子悬浮液的冬孢子悬浮液至少镜检5张玻片，每片按视野依次全部检查.观察冬孢子特点，注意观察冬孢子壁的厚薄，颜色等特征.
9.2.5孢子球的萌发试验
在离心管中加入适量1%的次氯酸钠溶液，将9.2.3所获得的沉淀物涂于载玻片上，在体视显微镜下挑取一定数量的冬孢子球放人，用涡旋振荡器混合，消毒5min后，以3000r/min离心1min，立即用微量加样器吸去上清液，加无菌水离心清洗2次，将冬孢子球沉淀物转至洋葱琼脂培养基（参见附录B）上培养，条件为13℃～22C、12h间原光照、75%的空气湿度，重复3个培养Ⅲ.
10鉴定特征
10.1寄主植物症状
轻的洋葱鳞茎常形成铅色到黑色的瘤肿条斑.洋葱叶片上形成铅色到黑色的有轻微变厚的条斑或水 洋葱、大蒜等鳞茎表面有铅色泡状囊肿，囊肿剩破后有典型的黑粉症状，鳞茎个头小、干腐，发病较泡，当增厚区域较大时可引起子叶向下弯曲.随着叶片基部病斑的扩大，病斑破裂漏出大量的黑色粉末.重病植株通常变得矮小，易死亡.
