团体标准
Determination of glutelin content in polished rice - Coomassiebrilliant blue method
前言
定起草. 本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由中国出入境检验检疫协会进出口食品标准化技术委员会（CIQA/TC10）提出并归口.本文件起草单位：江苏苏中健康产业有限公司、南京海关动植物与食品检测中心、南京财经大学、江苏苏中药业研究院有限公司. 本文件主要起草人：葛海涛、陆慧媛、丁超、丛旭东、王正俊、郭丽萍、王殿广、华雨薇、王泽铬、张其荣、刘强、庄昕波、赵思琪.本文件知识产权归中国出入境检验检疫协会.任何单位或个人未经许可，不得以营利为目的，印刷、出版、翻译、转发或复制全文或部分文字.
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精米中谷蛋白含量的测定
考马斯亮蓝法
1范围
本文件描述了精米中谷蛋白含量的考马斯亮蓝测定方法.本文件适用于精米中谷蛋白含量的测定.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
谷蛋白glutelin
含于稻米中，溶于稀酸或稀碱但不溶于纯水、中性盐溶液、乙醇的储藏蛋白质的总称.
3. 2
精米polishedrice
稻谷脱壳后形成的糙米经碾米加工，去除大部分层和胚芽后，主要以胚乳制成的成品粮.
4方法提要
精米粉碎过筛后经去离子水、5%氯化钠溶液、70%乙醇洗涤，经0.04mol/L氢氧化钠溶液提取后，得到纯度较高的谷蛋白，在595nm波长下采用考马斯亮蓝法G-250测定谷蛋白含量.
5设备和试剂
5.1设备
5.1.1粉碎机.5.1.2高速离心机：转速不低于4000r/min.5.1.3恒温磁力搅拌器：可控温度不低于60℃.5.1.4紫外可见分光光度计：波长范围190nm-900nm.5.1.6具塞离心管：10ml、15mL、100mL. 5.1.5标准检验筛：孔径为100目、120目.
5.1.7涡旋混匀仪.5.1.8分析天平：感量为0.01g、0.0001g. 5.1.9恒温水浴锅.
5.2试剂
除另有规定，所用试剂均为分析纯，试验用水需符合GB/T6682中二级水的规定要求.
5.2.1去离子水5.2.2石油醚.5.2.3氯化钠.5.2.4无水乙醇.5.2.6氢氧化钠. 5.2.585%磷酸.5.2.7考马斯亮蓝G-250.5.2.895%乙醇.5.2.9牛血清白蛋白：CAS：9048-46-8，纯度大于等于98.0%.
5.3溶液配制
5.3.170%乙醇：量取70mL无水乙醇，加水稀释至100ml.5.3.20.01%考马斯亮蓝G-250溶液：称取0.1000g考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95%乙醇中，加入5.3.30.04mol/L氢氧化钠溶液：称取0.16g氢氧化钠溶于适量去离子水中，稀释至100ml. 85%的磷酸100mL，用去离子水定容至1L，混匀过滤，于棕色瓶中保存.5.3.45%氯化钠溶液：称取5.00g氯化钠溶于适量去离子水中，稀释至100ml.
5.4标准溶液配制
并定容至100mlL，超声5min至溶解完全，即为0.1mg/mlL标准蛋白质溶液.标准溶液建议现配现用， 0.1mg/mL标准蛋白质溶液：精密称取牛血清白蛋白0.0100g，加0.04mol/L氢氧化钠溶液溶解或4C下避光保存1-3d
6分析步骤
6.1样品的制备
使用粉碎机将精米样品粉碎后过120目筛，过筛后的样品和石油醚按照1：4（W/V）混合，室温下脱脂6h，弃去石油醚后，置于通风橱下过夜风干，收集粉末样品过100目筛，于干燥Ⅲ中储存备用.
6.2样品中谷蛋白的提取
6.2.1去离子水洗涤
的大烧杯中水浴加热，同时大烧杯置于恒温磁力搅拌器上搅拌30min，搅拌完成后转移至50ml离心 称取2.0g脱脂过筛的样品粉末于100mL烧杯中，加入40ml去离子水，置于装有60C去离子水管内，6000r/min离心10min，弃去上清液后重复提取1次，沉淀备用.
6.2.25%氯化钠溶液洗涤
向上述含沉淀的离心管中分多次加80ml5%氯化钠溶液，涡旋2min至沉淀溶解分散后转移至
100ml烧杯内，烧杯置于装有60C去离子水的大烧杯中水浴加热，同时大烧杯置于恒温磁力搅拌器上搅拌30min，等量分装至2个50mlL离心管内，6000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀备用.
6.2.370%乙醇洗涤
向上述含沉淀的离心管中分多次加入60mL70%乙醇，涡旋2min至沉淀溶解分散后转移至100mlmin，等量分装至2个50mL离心管内，6000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀备用. 烧杯内，烧杯置于装有60℃去离子水的大烧杯中水浴加热，同时大烧杯置于恒温磁力搅拌器上搅拌10
6.2.40.04mol/L氢氧化钠溶液提取
向上述含沉淀的离心管中分多次加入50ml0.04mol/L氢氧化钠溶液，用玻璃棒将沉淀搅拌溶解至无明显大颗粒沉淀时，涡旋2min后转移至100mL烧杯内，烧杯置于装有45C去离子水的大烧杯中 水浴加热，同时大烧杯置于恒温磁力搅拌器上搅拌90min，等量分装至2个50ml离心管内，10000r/min离心10min，保留上清液，用考马斯亮蓝法测谷蛋白含量.
6.3谷蛋白含量测定
6.3.1标准曲线绘制
于6支10ml具塞离心管中，用0.04mol/L氢氧化钠溶液补至1.0ml，摇匀.每管分别加入5.0mL 精密吸取0.1mg/mL标准蛋白质溶液0.1mlL、0.2mL、0.4ml、0.6mL、0.8ml、1.0ml，分置考马斯亮蓝G-250溶液，盖塞后上下倒转5次混匀后放置2min，以0.04mol/L氢氧化钠溶液1.0mL与5.0mL考马斯亮蓝G-250混合液（0号试管）作空白对照，用1cm光径比色m在595nm波长下测量吸光度值.以蛋白质含量为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程.牛血清白蛋白工作溶液配制方法见表1.
表1牛血清白蛋白工作溶液配制表
管号0 1 2 3 4 5 60.1 mg/ml标准蛋 0 0.1 0.2 0.4 0.6 8′0 1.00.04mol/L氢氧化 白质溶液（mL）钠溶液（mlL） 1.0 6′0 8′0 0.6 0. 4 0.2 0蛋白质含量（u 0 10 20 40 09 08 100g)
6.3.2样品溶液含量测定
精密吸取样品溶液1.0mL，放入10mlL一次性离心管中（每个样品设3个平行管），加入5.0mL考马斯亮蓝G-250溶液，轻轻上下倒转5次混匀，避免剧烈摇晃产生泡沫.静置反应2min后，以空白管为参比，用1cm光径比色Ⅲ于595nm处测量吸光度值.若样品吸光度超出0.3-0.6范围，应将其稀 释适当倍数后重新测定，以保证数据稳定性.最后根据标准曲线计算谷蛋白含量.
7结果计算
样品中谷蛋白含量按式（1）计算：
