中华人民共和国国家标准
GB/T30744-2014
The technology specification for the pre-treatment of deep-sea microorganismsamples
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
目 次
前言1范围2规范性引用文件 术语、定义和缩略语试剂和材料5仪器与设备8深海微生物菌种分离 样品现场处理.9深海微生物基因组DNA提取10深海微生物宏基因组DNA提取 1211深海生物样品及微生物资源保存 13附录A（资料性附录）深海微生物样品前处理记录表格式 附录B（资料性附录）耐压菌株分离 22 28附录C（资料性附录）微生物菌种分子鉴定 29附录D（资料性附录）宏基因组Cosmid文库构建表A.1深海样品采样记录表 表A.2深海微生物分离鉴定记录表 22 22表A.3深海微生物基因组DNA提取记录表 ......... 23表A.4 深海样品宏基因组DNA提取记录表表A.5 深海样品保藏记录表 24表A.7 表A.6 深海放线菌保藏记录表 深海细菌保藏记录表 24 25表A.8 深海真菌保藏记录表 26表A.9深海样品宏基因组DNA文库记录表表C.116SrRNA基因通用引物的适用范围 29
前言
本标准由国家海洋局提出. 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由全国海洋标准化技术委员会（SAC/TC283）归口.本标准起草单位：国家海洋局第三海洋研究所.本标准主要起草人：曾润额、邵宗泽、叶德赞、陈新华、林荣澄、孙风芹、徐丽美、盖英宝.
深海微生物样品前处理技术规范
1范围
本标准规定了深海微生物样品前处理中的技术要求、工作条件、深海样品现场处理、微生物及遗传物质提取、保存及资料处理.
本标准适用于水深大于或等于1000m的深海微生物样品的现场处理、提取与保存.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T12763.4海洋调查规范第4部分：海洋化学要素调查GB/T12763.6海洋调查规范第6部分：海洋生物调查HY/T058海洋调查观测监测档案业务规范
3术语、定义和缩略语
下列术语、定义和缩略语适用于本文件.
3.1术语和定义
3.1.1
深海deep sea
水深大于或等于1000m的海洋区域.
3.1.2
微生物样品microorganism samples
已培养或已提取纯化的，具有一定科学意义，具有实际或潜在实用价值的，可直接应用于各种科学研究的各种菌株（包括细菌、真菌、放线菌等）、DNA/RNA等遗传物质：以及包含上述菌株和遗传物质的深海样品，包括水样、沉积物样、岩石样等.
3.1.3
前处理pre-treatment
在开展深海微生物研究工作之前对采集自深海的各种微生物样品（见3.1.2）所进行的各种处理，包括：深海生物样品现场处理、深海微生物菌种分离、深海微生物基因组DNA提取、深海微生物宏基因组DNA提取、深海生物样品及微生物资源保藏.
3.1.4
低温微生物cold-adapted microorganism
在37C以下的温度中生长良好的微生物（包括细菌、真菌、故线菌等），最适生长温度等于或低于25 C.
3.1.5
嗜热微生物thermophile
在等于或高于55℃的湿度中生长良好的微生物（包括细菌、真菌、放线菌等）.
3.1.6
宏基因组metagenome
生物的基因信息. 不经菌株分离筛选步骤，直接从环境样品中提取的遗传物质（DNA或RNA），包含了样品中微
3.1.7
寡营养培养基oligotraphicmedium
与正常培养基成分相同，但碳源、氮源营养物质浓度减为十分之一的培养基.
3.2缩略语
16SrRNA:细菌染色体上编码核糖体 RNA16S 亚基的基因18SrRNA：真核生物染色体上编码核糖体RNA18S亚基的基因Amp:氨苄青霉素（Ampicillin）BOD：生化需氧量（Biochemical oxygen demand) CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（Cetyltriethylammnonium bromide）dATP：脱氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosine triphosphate）dGTP：脱氧鸟甘三磷酸（Deoxyguanosine triphosphate)DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）DMF :二甲基酰胺(N N-DimethylIformamide) EDTA;乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid)GYT：甘油酵母膏蛋白陈培养基（Glycerol yeast extract tryptone medium）IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)LB:肉汤培养基（Luria-bertani） OD：光密度（Optical density)PFGE：脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis)PDA：马铃薯葡萄糖培养基（Potato dextrose agar)RNase A:核糖核酸酶 A（RNAase A)SOC：含分解代谢抑制物的超级肉汤培养基（Super optimal broth with catabolite repression） SDS：十二烷基硫酸钠（Dodecyl sulfate，sodium salt)Tris：三羟甲基氨基甲烷(2-Amino-2-hydroxymethyl-13-propanediol)TE:Tris-HCI和 EDTA-Na配成的缓冲液TBE：Tris-HC1、硼酸和 EDTA-Na配成的缓冲液X-gal：5-4氯3-号噪-β-D-半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside) YPD:酵母膏蛋白陈葡萄糖培养基（Yeast extract peptone dextrose medium）入DNA/EcoRIHindⅢl经EcoRI酶（4.1)和HindⅢ酶（4.2)两种核酸内切酶消化后的入噬菌体 DNA
4试剂和材料
4.1EcoR I酶.4.2 Hind II酶.4.3BamHI酶.
×除非另有说明，在操作中仅使用分析纯试剂和电阻率大于18MΩcm的超纯水.
