中华人民共和国国家标准
GB/T31808-2015
向日葵白锈病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Albugo tragopogonis (Pers.） S. F. Gray
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口本标准起草单位：中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、新疆生产建设兵团农业技术推广总站.本标准主要起草人：张祥林、王、赵冰梅、王文正、张江国、乾义柯.
向日葵白锈病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了向日葵白锈病菌的检疫鉴定方法.本标准适用于向日葵种子和植株中向日葵白锈病菌的检疫和鉴定.
2仅器和用具
生物显微镜、体视显微镜、超净工作台、高压灭菌器、高速离心机、制冰机、全温水浴、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、往复式振荡器、培养Ⅲ、烧杯、酒精灯、三角瓶、载玻片、盖玻片、摄子、剪刀、量筒、吸管.
3试剂
乳酸、苯酚、甘油、棉蓝、藏红花、次氯酸钠（NaCIO)，十二烷基硫酸钠（SDS），三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCI），氯化镁（MgCI），乙二胺四乙酸四钠盐（EDTA），氢氧化钠（NaOH），醋酸钠（NaOAc），氯化钾（KCl），十六烷基三甲基澳化铵（CTAB），无水乙醇（Ethanol），苯酚（Phenol），三氯甲烷（Chloro form），异丙醇（Isopropanol)，异戊醇（Isoamyl alcohol），核酸染料（SYBR Green I），蛋白酶K，TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase），脱氧核糖核昔三磷酸（dNTP），DNA分子量标记（DNAMarker)TAE电泳缓冲液（TAE buffer）.
4检疫鉴定方法
4.1田间症状检查
在向日葵现蕾中期至盛花期，到向日葵隔离种植区或大田进行调查，观察向日葵植株发病情况.
4.2种子带菌检查
选取5g小的向日葵种子，置于干净三角瓶中，加人200mL清水和少量洗衣粉，在往复式振荡器上振荡10min，倒去洗涤液，再加入等量的清水，重复洗涤3次～5次，直至洗净向日葵种子上的种衣剂（如无种子包衣，可省略此步），晾干，剥开向日葵种子，将果皮和种仁一起放入装有乳酚油的烧杯中，酒精灯下煮沸3min，冷却后在解剖镜下用镊子剥取内果皮和种皮，放人一干净培养Ⅲ中，加人少量棉蓝藏红花染色液，静置5h左右，用95%乙醇清洗后，用摄子夹取内果皮或种皮置于载玻片上，加一滴乳酚 油作浮载剂，董片镜检.
4.3病原菌形态观察
物显微镜下观察该病菌形态特征，记录孢囊梗、孢子囊、卵孢子的形状及大小. 用干净刀片刮取少量向日葵病叶背面（或叶柄、花盘等）的白色疱斑中的病菌，置于载玻片上，在生
将制备的向日葵内果皮或种皮玻片，置于生物显微镜下观察病菌形态特征，记录孢囊梗、孢子囊、卵孢子的形状及大小.
GB/T 31808-2015
4.4分子生物学检测
4.4.1DNA提取
取向日葵种子或具疑似症状的向日葵病组织，用CTAB法或试剂盒法提取核酸（见附录B）.
4.4.2巢式PCR检测
向日葵白锈病菌的巢式PCR检测方法见B.2.
4.4.3实时荧光PCR检测
向日葵白锈病菌的实时荧光PCR检测方法见B.3.
5签定特征
5.1为害症状
向日葵受白锈病菌侵染为害后，在叶片正面产生淡黄色或淡绿色病斑，直径1mm～2mm，叶片背面相对应的部位形成突起的白色疱斑.疱斑表皮破裂后散出白色粉状物（病原菌孢子囊）.疱斑可相互 汇合形成大的斑块.田间发病严重时向日葵叶柄和花盘上也会发病.
5.2病原形态
孢子囊成串产生.孢子囊球形、卵形或多角形，单胞，无色，（16.32gm~21.18pm）×（15.12pm~ 向日葵白锈病菌菌丝无色、分支，产生短的孢囊梗，（31.48μm~59.19μm）×（6.07μm~16.12pm）.20.54μm）.卵孢子福色至黑色，壁有剩突，生长在寄主组织（向日葵种子、叶片、叶柄、花盘等）中，大小（46.57 μm~66.82xm）×（45.49pm~65.77μm）.孢子囊在水滴中30min就可前发，产生游动孢子，游动孢子直径6pm～12m，具1条鞭毛，经染色后，带菌向日葵种子的果皮和种皮中可观察到蓝色菌丝体、孢子囊和孢囊梗，以及褐色卵孢子，
向日葵白锈病菌的形态图参见附录C.
5.3巢式PCR检测结果
在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，通用引物NL1/N14首轮PCR扩增片段大小为700bp特异性引物ATHP3/ATHP4第二轮PCR扩增片段大小为370bp.
5.4实时荧光PCR检测结果
当空白对照的Ct值≥40.供试菌株的C值≤36，则检测结果为阳性，否则为阴性.
6结果判定
田间向日葵为害症状同5.1，向日葵病组织（向日葵病叶和种子）中病原菌的形态特征与5.2的描述一致，可判定为向日葵白锈病菌.
在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，巢式PCR扩增获得片段大小为370bp的条带，可判定为向日葵白锈病菌.
在阳性对照、阴性对照和空自对照结果均正常的情况下，用实时荧光PCR法检测结果为：
--Ct值小于或等于36，则判定为向日葵白锈病菌；
-Ct值大于或等于40，则判定为非向日葵白锈病菌；于或等于40，判定同上：如果检测C值仍在36~40之间，则应进行形态学方法鉴定.
7样品与原始数据保存
7.1样品保存
存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式妥善保存.如样品中发现向日葵白锈病菌，该样品应保存半年以上，以备复验，如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕，保存期满后应经灭菌处理.
7.2原始数据保存
样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁.
7.3菌种保存
用干净剪刀将具典型症状的向日葵白锈病叶剪成1cmX1cm左右的小片，置于菌种保藏管中，经脱水干燥后封好管盖，置于4C黑暗条件下保存至少12个月，以备复验、谈判和钟裁.
