中华人民共和国国家标准
GB/T33807-2017
Detection of genetically modified ponents in maizeGenechipmethod
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国生物芯片标准化技术委员会（SAC/TC421）提出并归口.
本标准主要起草单位：四川华汉三创生物科技有限公司、国家农业标准化监测与研究中心（黑龙江）、广东产品质量监督检验研究院、黑龙江省粮油卫生检验监测站.
本标准主要起草人：黄广平、彭丽萍、余之蕴、张金龙、王志强、王勇强、孔鲁裔、魏民伟、张春红、尹志坚、王海宽.
玉米中转基因成分的测定 基因芯片法
1范围
本标准规定了玉米及玉米加工产品中转基因成分的检测方法.
Cry1Ab）抗虫玉米中转基因成分的定性检测，也适用于玉米加工产品中转基因成分的定性检测，本标准 本标准适用于转EPSPS基因、PAT基因、BAR基因耐除草剂玉米和转Bt基因（Cry1A105、规定的转基因成分最低检测限量是0.1%.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.6转基因产品检测基因芯片检测方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
GB/T19495.1、GB/T19495.6界定的术语和定义适用于本文件.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.
BAR;来源于杆菌Baciax αm yfoliqaefaciery 草丁腾乙酰转移酯基因（phosphinothricin acetyl-transferase gene)
bp:碱基对(base pair)
CaMV35S-P:来自于花椰菜花叶病毒的 35S启动子（Promoter from canliflower mosaicvirus）
CaMV35S-T：来自于花椰菜花叶病毒的 35S终止子（Termination sequence from cauli flower mosaic virus)
CrylAb:苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 Cry1Ab基因（Bacillas rharingiensis Insecticidal toxinCry1Ab gene)
Cry1A105 gene) Cry1A105：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 Cry1A105基因（Bacilfas rkwringienasis Insecticidal toxin
GB/T 33807-2017
dATP：脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)dCTP：脱氧甘三磷酸（deoxycytidine triphosphate）dGTP：脱氧鸟书三磷酸（deoxyguanosine triphosphate)DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate）dUTP：脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate)EPSPS：5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase)Ivr1：玉米转化酶 I基因[Zea mays invertase （Ivr1）gene] FMV35S-P:玄参花叶病毒35S 启动子[promoter from Figwort mosaicvirus （FMV 35S)]NC:阴性对照(Negative control)NOS-3’：朋脂碱合成酶基因终止子（Termination sequence of the nopaline synthase gene）PAT：草丁瞬乙酰转移酶基因(phosphinothricin N-acetyltransferase gene)PC：阳性对照(Positive control)Tag 酶：来自于栖热水生菌的 DNA 聚合酶（Thermus aquaticus DNA Polymerase)UNG 酶：尿喀啶-N-糖基化酶（uracil N-glycosylase)
4防污染措施
检测过程中防止交又污染的措施应按照GB/T19495.2的规定执行.
5抽样与制样
抽样与制样方法应符合GB/T19495.7的相关规定.
6原理
待检样品经DNA模板提取和核酸定量，采用多重PCR扩增体系，扩增其中可能含有的转基因玉测结果可以用肉眼直接判断或用芯片识读仪对杂交芯片进行扫描并判定结果. 米转基因特异性扩增序列.PCR扩增产物与固定有目标转基因特异性探针的基因芯片进行杂交后，检
7试剂与标准品
7.1试剂
除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水.7.1.1玉米转基因检测膜芯片法试剂组分应符合7.1.3~7.1.22的规定.7.1.2试剂组分规格和存放条件参见附录A. 7.1.3PCR反应使用的引物序列应符合表1的规定.
表1PCR反应使用的引物序列
目标基因 引物名称 序列 扩增片段大小/bpForward 5′-GCGCGATCATACGGAAAAGAT-3EPSPS Reverse 5′-biotin-TCGATGACTTGGCCGGTGAG-3* 123bpPAT Forward 5'-TGATATGGCCGCGGTTTGTGAT-3' 180bpReverse 5′-biotin-GGCCCAGCGTAAGCAATACC-3*BAR Forward 5′-CACCTGCTGAAGTCCCTGGA-3′ 193bpReverse 5′-biotin-GTACCGGCAGGCTGAAGTCCA-3*CrylA105 Forward Reverse 5′-ACTCGATCAGGTACAATGCCA-3* 5′-biotin-GCATCTGTTAGGCTCTCCAC-3* 113bpForward 5′-GACATGAACAGCGCCTTGAC-3′Cry1Ab Reverse 5′-biotin-TTGATGGTTGCAGCATCGAA-3′ 164bpForward 5′-AGTCCAAAGCCTCAACAAGG-3' 168bpFMV35S-P Reverse. 5′-biotin-CCCACTAACTTTAAGTCTTCGGTG-3*CaMV35S-P Forward 5′-GGCCATCGTTGAAGATGCCTC-3′ 144bpReverse 5′-biotin-TCATCCCTTACGTCAGTGGA-3*CaMV35S-T Forward 5′-CCAGATAAGGGAATTAGGGTTC-3′ 132bpReverse 5′-biotin-ACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGA-3* 5'-TGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT-3'NOS-3* Forward Reverse 5′-biotin-GCGCGCGATAATTTATCCTAGTTT-3′ 113bpForward 5′-GCTCCTAGCATTCCACGTCC-3?Ivr1 Reverse 5′-biotin-CCCTTGTGATACAGCGGACCT-3′ 117bp
7.1.4 膜芯片表面包被的目标基因探针序列应符合表2的规定.
表2目标基因探针序列
名称 序列 修饰基团 EPSPS 5′-ACCTTACCGTCGAGAOGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCCGCCTGGAAGGCCGCGGC-]* 5′-AminolinkeCePAT 5′-GCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTTGTGGCTGGTATTGCTT-3′ 5′-AminolinkerC6BAR 5′-CGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGCTTCAAGCACGGGAACTGGCATGACGTGGGTTTCTG-3′ 5′-AminolinkerC6CrylA105 5′-GACCGTGAATGTCCCAGGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTCTGCCCAATCTCCCATTG-3′ 5′-AminolinkerC6CrylAb 5′-GCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTOGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGG-3* 5′-AminolinkerC6FMV35S-P 5′-CAAAGTAAACTACTGTTCCAGCACATGCATCATGGTCAGTAAGTTTCAGAAAAAGACAT-}* 5′-AminolinkerC6CaMV3SS-T S′-AGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAAT-3* CaMV35S-P ′-AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATG-3* 5′-AminolinkerC6 5′-AminolinkerC6NOS-3′ 5′-TTATGATTAGAGTOCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGC-3' 5'-AminolinkerC61vr1 5′-AGATATTGTCCCATCAGCTGCTAGCTTTCGCGTATTGATGTCGTGACATTTTGCACGCA-3' 5′-AminolinkerC6
