中华人民共和国国家标准
GB/T 36779-2018
Detection and identification of Fusarium oxysporum f.sp.apii
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口
本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、浙江大学、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：张卫东、黄永辉、权永兵、宋风鸣、迟远丽、徐淼锋、廖力、林伟、李金庆、于金迪.
芹菜枯萎病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了芹菜枯萎病菌检疫鉴定的方法.
本标准适用于可能携带芹菜枯萎病菌的种子、种苗、植物残体及土壤中芹菜枯萎病菌的检疫鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2589植物病原真菌检测规范 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3芹菜枯葵病菌基本信息
中文名：芹菜枯菱病菌
学名 :Fasariusm o.xysporum Schlecht.f.sp.api Snyder et Hansen.1940
异名 =Fusari bu/bigenam Cooke et Massee.1887 Fasariam orthoceras Appel et Wollenw.1910 Fusarium angusrum Sherb.1915 Fusarium orthoceras var.apii ( Nelson et Sherb.) Wollenw et Rein- king.1935 Fusaria apii Nelson et Sherb.1937 Fusarium apii var pallicdu Nelson et Sherb.1937 Fusarium oxysporum f.api (Nelson et Sherb ) Snyder et Hansen. 1940 Fasarium bubigenum var.αpi (Nelson &. Sherb.) Raillo.1950
分类地位：真菌界（Kingdom Fungi）半知菌门（Deuteromycota）丝孢纲（Hyphomycetes）、瘤座孢目（Tuberculariales）瘤座孢科（Tuberculariaceae）、镰刀菌属（Fasarion）.
芹莱枯萎病菌的其他信息参见附录A.
4原理
其鉴定的主要依据. 芹菜枯萎病菌的危害症状、菌落的培养性状、寄主范围、分子生物学特性、致病性测定结果等特征是
5仪器设备、用具和主要试剂
5.1仪器
PCR仪、光照培养箱、生物显微镜（100×～1000×）、体视显微镜、组织研磨仪、生物安全柜、高速冷冻离心机、微量分光光度仪、电泳仅、凝胶成像系统、电子天平（感量0.0001g）、pH计、高压灭菌锅.
5.2用具
酒精灯、纱布、烧杯、接种针、接种环、培养Ⅲ、锥形瓶、棉花塞、载玻片、盖玻片、铝铂纸、解剖刀、解剖
GB/T 36779-2018
剪、镊子、记号笔、移液器（1000μL200μL、100μL、20μL、10pL、2.5μL）和离心管.
5.3主要试剂
无水乙醇、氯化钠、饱和酚、氯仿、次氯酸钠（NaCIO）、异丙醇、异戊醇、五氯硝基苯（PCNB）、冰醋酸、β-硫基乙醇、Tris-盐酸、NaEDTA、十二烷基硫酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、聚乙烯 毗略烷酮（PVP）、溴化乙锭、DNA分子量标准、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）.
除另有规定外，试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定.
6现场检疫
取样时应针对性检查，注意检查有无可疑病株，若有可疑病株应将其挑出来，并送实验室进一步检验鉴定.在以上针对性检查基础上，再按照SN/T2122的规定执行.
7检疫整定方法
7.1症状检查
7.1.1种子症状检查
其中一份用于PCR初筛，另一份用于病原菌的分离鉴定. 在解副境下挑选皱缩、干癌、变色、残缺的或有霉变的种子，分成2份，每份种子样品不少于500粒，
7.1.2植株症状检查
取待检植株，观察植株是否存在生长不良、矮小衰弱、叶柄褪色、叶片变黄等外观变化，纵切叶柄检查维管束是否变褐褪色（参见附录B），检查植株有无附着土壤.
7.2PCR初筛
7.2.1样品DNA提取
取挑选的种子、植株可疑病变组织或土壤提取DNA（见附录C）.
7.2.2PCR 检测
PCR检测方法见附录D，PCR初筛检测结果阳性进行7.3病菌分离培养；PCR初筛检测结果阴性，则可报告未检出芹菜枯菱病菌.
7.3病菌分离培养
7.3.1种子
将种子用有效成分为1.25%的次氯酸钠（NaClO）溶液表面灭菌3min~4min，无菌水洗涤2次，放25C光照培养箱里黑暗12h光照12h培养，观察种子上是否出现白色菌丝或霉状物，挑取边缘菌丝移 在垫有3层无菌湿滤纸的培养Ⅲ中，每Ⅲ10粒，在20C~22C下故置24h后，-20C冷冻24h，转至置PDA培养基平板上纯化，包衣种子可用双蒸水洗去表面的种衣剂.
7.3.2植物组织
2 取待检样品的组织切成1cm长的小段，冲洗掉表面的泥土杂物后，在75%乙醇中浸泡1min，经无
菌水洗涤后，用灭菌解剖刀横切成长度为2mm~4mm的小方块，放置在垫有3层无菌湿滤纸的培养Ⅲ中，每Ⅲ5片~10片，转至25C光照培养箱里黑暗12h光照12h培养，观察植物残体表面是否出现白色菌丝或霉状物，挑取边缘菌丝移置PDA培养基平板上纯化.
7.3.3土壤
五氯硝基苯（PCNB）的PDA平板上，5个重复，转至25C光照培养箱里黑暗12h光照12h培养，观察菌落的产生情况将可疑菌落转移至PDA培养基平板上纯化.
7.4分离物的纯化
分离物的纯化采用琼胶平板表面单孢子挑取法进行纯化，将分离物上产生的孢子用灭菌水洗下，稀释到每个培养Ⅲ中30个左右的孢子，取一定量的孢子悬浮液加到洁净的硬琼胶培养基平板上，25℃条件下过夜放置.在生物显微镜下检查，用消毒的解剖刀或接种针将初萌发单个孢子的小菌块转移到PDA培养基上.
7.5形悉学观察
纯化后的分离物转到PDA上培养，观察记录菌落形态、颜色，大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子的形态特征：测量菌丝生长速率及分生孢子、厚垣孢子的大小.
7.6病菌分离物的PCR检测
采用CTAB法（见附录C）提取疑似分离物DNA，PCR检测见附录D
7.7测序
PCR扩增结果为阳性，需将PCR扩增产物进行测序比对，以进一步确证是否为尖孢赚刀菌.
7.8致病性试验
将在PDA上培养10d的分离物用100mL无菌水冲洗分生孢子，制成1.0×10个/mL分生孢子悬浮液，与商业栽培土充分混匀，装入塑料盆中，对照采用清水代替孢子悬浮液接种.将4叶～5叶期苗龄的健康芹菜苗移植盆中，置于温室（25℃C～28C)，每天14h~16h光照，正常淋水管理，接种5周后检查芹菜植株有无发病，并再次从发病部分离病原菌，观察其形态.
8鉴定特征
8.1培养性状
该病菌在PDA平板上，生长迅速，培养5d后，菌落直径通常4cm~5cm，菌落突起絮状，菌丝由白色变为淡紫色、淡橙色或米黄色，基物表面淡紫色（参见附录B）.
8.2病原特征
菌丝无色透明，具隔膜，气生菌丝有隔，直径1.5μm~3μm.小型分生孢子单胞，无色透明，椭圆形或卵形，大小4.7μm~7.4μm×1.5pm~3.7pm；大型分生孢子键刀形，较稀少，多数为3个隔膜，顶细胞较尖细，底部具足细胞，大小18.7pm~29.6pm×3.7μm~4.8μm.厚坦孢子间生或顶生，球形，单个或成对.
